干细胞的培养条件和培养基

干细胞的培养条件

1. 培养条件

1. 环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。

2. 设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。

3. 实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml 或50ml 离心管、脱脂棉花、封口膜等。

4. 试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。

5. 试剂的配制：

1. DMEM 培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3

2. MEF 培养基：DMEM 培养基中含10%FBS , 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素

3. ES 培养基: ES培养基：DMEM 培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM 丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子

4. D-Hank's ： 0.8%NaCl , 0.04%KCl , 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红

5. 0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶

6. ES 细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO 7. MEF 细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO

8. Feeder 细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO

9. 丝裂霉素C : 根据产品说明书来配制

2. 培养步骤

常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。

1. 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF ）的复苏

胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。

1. 在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。

2. 把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF 培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min 离心收集细胞。

3. 吸掉上清（除去冻存液中的DMSO ），用10ml 预热的MEF 培养基重悬细胞后，加到一个10cm 的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

4. 根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。

2. 滋养细胞层（feeder cells layer）的制备

1. 把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml 新鲜的MEF 培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C ，混匀后放入培养箱培养2h 。

2. 把含有丝裂霉素C 的培养基用无菌的15ml 离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h ）。用PBS(不含二价离子) 洗涤细胞2到3次后，用1ml 含有EDTA 的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min ，直到细胞悬浮起来。

3. 用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g 离心5min 。

4. 去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿

中，用MEF 培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min ，之后把明胶吸掉即可）

5. 一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可

用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF 培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。

3. 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏

1. 在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。

2. 把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES 培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min

离心收集细胞。

3. 吸掉上清（除去冻存液中的DMSO ，用10ml 预热的ES 培养基重悬细胞后，加到一个10cm 的铺有滋

养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。

4. 根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻

存或用于后续试验。

4. 小鼠胚胎干细胞的传代

1. 吸掉培养基，用PBS(不含二价离子) 洗2~3次后，加1ml 含有EDTA 的胰酶消化细胞，37℃培养箱放

置约5min ，直到细胞基本悬浮起来。

2. 用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g 离心5min 。

3. 去掉上清，用几毫升ES 培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有

滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES 培养基培养。ES 细胞的分配比可以是1:1到1:10。

5. 小鼠胚胎干细胞的冻存

1. 吸掉培养基，用PBS(不含二价离子) 洗2~3次后，加1ml 含有EDTA 的胰酶消化细胞，37℃培养箱放

置约5min ，直到细胞基本悬浮起来。

2. 用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g 离心5min 。

3. 去掉上清，用预先配制好的预冷的ES 细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般

一个长满的10cm 细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml 的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min ，-20℃20min ，-80℃过夜后迅速转入液氮中。

3. 注意事项

1. 丝裂霉素C 在操作时要避光，避免其分解。

2. ES 细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格

3. ES 细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。

4. 为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。