基质固相分散

美国路易斯安那州立大学Steven A. Barker教授，自1989年首次提出了基质固相分散（matrix solid phase dispersion，MSPD ）[11]的样品前处理技术，作为一种专利工艺，最初是用于从动物组织中分离有机磷酸酯类、苯并咪唑驱虫药和β-内酰胺抗生素类药物，文章表明了MSPD 萃取次数少、消耗更少量的溶剂、可同时执行提取和净化过程，同时Barker 教授也对MSPD 给予了理论解释。Barker 在2000年、2007年陆续发表了相关研究的综述文章[12~14]，总结和评论了该前处理手段在食品分析领域每隔十年的发展和进步。MSPD 作为简单的样品提取技术，越来越多地被用来从固体、半固体、高粘性的环境、生物基质中提取有机污染物或药物，也逐渐成为了天然产物的提取手段。

MSPD 方法采用亲脂性固相填料C 18，与固体、半固体、高粘性液体一起研磨，得到半干燥的颗粒混合物，易于作为填料装柱，装入萃取柱或注射器针筒里，然后可以用极性、非极性的多种有机溶剂充当洗脱剂，将各种待测药物、污染物等从生物基质中分离出来。C 18聚合物通过破坏和分散细胞膜磷脂、组织液成分、细胞内成分、胆固醇等，充当分散剂的作用。其工作原理为：样品组织与固体材料研磨的过程中，有机相与硅胶固相萃取材料表面相互键合，利用剪切力作用将组织分散，样品组分溶解和分散在固体支持物表面，这大大增加了萃取样品的表面积，样品会按照各自的极性分布在有机相物质表面。近年来，发展了一些可替代性的分散剂材料，如酸性SiO 2、石英砂、丙烯酸类聚合物、硅藻土和Al 2O 3，这些材料的运用可以增强MSPD 的选择性。然而，基质固相分散技术常用的分散剂缺乏选择性。利用MSPD 对样品进行前处理，需要根据样品的性质和待分析的物质，对分散剂、洗脱剂进行优化，必要时还需要对洗脱液进行进一步的处理和纯化。洗脱剂的选择，主要取决于基质的性质和待测物分子的极性。为了提高基质固相分散技术的选择性，样品经分散剂处理后，净化过程也逐渐显得尤为重要。

图2.1基质固相分散过程[15]

(I) 将样品与分散剂混合研磨; (II) 将均化后的混合物粉末转移到注射器针筒中，压实; (III) 使用真空泵控制流速，用溶剂/混合溶剂来洗脱目标化合物 2.2实验部分 2.2.1 试剂与材料

磺胺类药物，包括磺胺噻唑（Sulfathiazole ）、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺甲基异恶唑（Sulfamethoxazole ）及磺胺间二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine ）购于北京百灵威科技有限公司（北京，中国），四种磺胺类药物标准品的结构如图2.2所示。准确称取适量的磺胺类药物标准品，用色谱级乙腈配制成浓度为500 μg mL-1的标准储备液，储存于4 ℃冰箱中待用，使用时以乙腈逐级稀释标准储备液至不同浓度的混合标准工作溶液。实验中所用的色谱纯的乙腈、甲醇购于Fisher 公司（美国）；分析纯的甲醇、丙酮及乙酸乙酯购于北京化工厂（中国），实验用水均为Milli-Q 水处理系统（美国）制得的二次蒸馏水。

3种不同类型分散剂，包括硅胶（100目）、硅藻土（400目）及中性氧化铝（200目）均购于中国药品生物制品检定所。使用之前，将分散剂置于650 ℃条件下灼烧4 h，之后烘干2 h，置于干燥的密封容器中保存。

本实验选取的牛肉样品均购于当地超市，通过绞肉机将其绞至肉泥状，置于

-20 ℃冰箱中保存待用。 2.2.2仪器与设备

超快速液相色谱仪（LC-20ADXR ，日本岛津公司），紫外检测器（SPD-20A ），色谱柱（Sulfa C18，150 mm×4.6 mm，3 mm，日本岛津公司）。基质固相分散装置由10 mL 玻璃材质注射器自制而成。 2.2.3 样品制备

准确称取0.20 g牛肉样品于玛瑙研钵中，加入一系列适当浓度的工作溶液，研磨20 min直至混匀，于暗处干燥12 h待用。 2.2.4 样品处理

准确称取0.2 g 牛肉样品于研钵中，加入一定质量的分散剂，研磨15 min 直到均匀。取一只10 mL 注射器，在其底部放入一层脱脂棉，加入0.5 g 分散剂作为净化层，然后将混合物转移至注射器内，另取一层脱脂棉置于混合物上方，使用注射器活塞将基质固相小柱压实。取适量的洗脱液重力洗脱待测目标物。收集洗脱液于试管中，用氮气吹干，使用乙腈定容至100 µL ，过0.22 µm 滤膜，所得溶液为分析溶液，供液相色谱分析。 2.2.5 超快速液相色谱条件

流动相A 为水，B 为乙腈。流动相为A ：B = 70 ：30（V / V)，流速为0.4 mL min-1，柱温箱温度为40 ℃，检测波长为270 nm，进样体积为5 μL。 2.3 结果与讨论 2.3.1 条件优化

为了得到最优实验条件，对影响基质固相分散提取的条件均进行了优化，包括分散剂的种类、洗脱剂种类、洗脱剂用量、样品与分散剂质量比。在条件优化实验中，加标样品的浓度为1250 ng g-1，每组实验平行测定3次。 2.3.2 分散剂的种类

通过MSPD 提取牛肉样品中的4种磺胺类药物残留，为了获得较高的提取效果，本实验分别考察了硅胶、硅藻土及中性氧化铝作分散剂时的提取和净化能力。实验结果如图2.3所示，当硅胶和中性氧化铝作为分散剂使用时，对样品的分散效果不理想，4种磺胺类化合物回收率较低；当选用硅藻土作为分散剂时，对目标物的提取能力最强，回收率高于其它两种分散剂。因此，本实验选择硅藻

土作为MSPD 的分散剂。

图2.3分散剂对磺胺类化合物回收率的影响

牛肉样品：0.2 g 。洗脱剂：乙腈。洗脱剂体积：6 mL 。样品与分散剂质量比为1:4

2.3.3 洗脱剂的种类

为了获得较高的提取效果，本实验分别选取了不同极性的洗脱溶剂，包括乙腈、甲醇、丙酮及乙酸乙酯，考察不同的溶剂对目标化合物的洗脱能力。实验结果如图2.4所示，结果表明，丙酮对于磺胺噻唑具有较好的提取效果，而对磺胺甲基嘧啶、磺胺甲基异恶唑及磺胺间二甲氧嘧啶的洗脱能力很弱，提取效果不佳；选取乙腈和乙酸乙酯作为洗脱剂时，四种磺胺类药物的回收率有所提高；而选取甲醇作为洗脱剂时，回收率明显提高。由于甲醇对磺胺类药物较强的洗脱能力，因此选择甲醇作为MSPD 的洗脱剂。

图2.4洗脱剂对磺胺类化合物回收率的影响

牛肉样品：0.2 g 。分散剂：硅藻土。洗脱剂体积：6 mL 。样品与分散剂质量比为1:4

2.3.4 洗脱剂的体积

由于洗脱剂体积对目标化合物的提取效果具有一定影响，因此洗脱剂体积在本实验中被考察。本实验中甲醇作为洗脱剂，选取体积为4，6，8，10 mL的甲醇用于洗脱。实验结果如图2.5所示，当洗脱剂体积从4 mL 增加到6 mL时, 磺胺类化合物的回收率随洗脱剂体积的增加而增大；当洗脱剂体积由6 mL增加到 10 mL时，四种化合物的回收率稍有降低。因此，本实验选择6 mL的甲醇作为洗脱剂。

图2.5洗脱剂体积对磺胺类化合物回收率的影响

牛肉样品：0.2 g。分散剂：硅藻土。洗脱剂：甲醇。样品与分散剂质量比为1:4

2.3.5 样品与分散剂质量比

本实验中，分别选取0.4，0.6，0.8 和 1.0 g 硅藻土作为分散剂，使样品与分散剂质量比分别为1∶2，1∶3，1∶4和1∶5。实验结果如图2.6所示，当硅藻土质量由0.4 g 增加到0.8 g，随着硅藻土质量的增加，四种磺胺类化合物回收率显著提高；由0.8 g 增加到1.0 g 时，回收率出现降低的趋势，这是由于分散剂质量越大，对目标化合物的吸附作用也随之增强，导致洗脱不完全。因此，1∶4为样品与分散剂的最佳质量比。

图2.6样品与分散剂的质量比对磺胺化合物回收率的影响

牛肉样品：0.2 g。分散剂：硅藻土。洗脱剂：甲醇。洗脱剂体积：6 mL

2.3.6 工作曲线、线性范围、检出限和定量限

在最优实验条件下，检测一系列不同加标浓度（25 ~ 2500 ng g-1）的牛肉样品，根据得到的4种磺胺类化合物的色谱峰面积A 与样品中磺胺类药物的浓度c 进行线性回归，创建工作曲线。线性方程，相关系数，检出限（LOD ，S/N=3）及定量限（LOQ ，S/N=10）列于表2.1中。实验结果表明，4 种磺胺类化合物在25 ~ 2500 ng g-1范围内线性关系良好，相关系数r 为0.9995 ~ 0.9998；检出限在4. 39 ~ 7. 82 ng g-1之间，定量限处于14.62 ~ 26.08 ng g-1之间。

表2.1 4种磺胺类化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Linear

Analyte

range (ng/g)

Sulfathiazole

Calibration equations

Correlation coefficient (r)

LOD (ng/g)

LOQ (ng/g)

25～2500

Sulfamerazine

25～2500

Sulfamethoxazole

25～2500

Sulfadimethoxine

25～2500

2.3.7 精密度

y = 22.67x +11943.0

y = 25.11x + 1324.70

y =24.76x + 3292.75

y =28.90x + 3143.45

0.9995 0.9998 0.9996 0.9995

7.82 4.39 5.42 5.72

26.08 14.62 18.07 19.07

为了考察方法的精密度，对牛肉样品进行不同加标水平的分析。日内精密度为在同一天内平行测定五次样品，而日间精密度为连续五天，每天分析一次样品。实验结果如表2.2所示，4种磺胺类化合物的日内精密度和日间精密度分别为1.9% ~ 12.4% 和2.1% ~ 12.7%。

表2.2 4种磺胺类化合物回收率和相对标准偏差（n =5） Analyte

Concentration (ng/g)

Intra-day

RSD (%)

Inter-day

RSD (%)

Recovery (%)

Recovery (%)

Sulfathiazole

Sulfamerazine

Sulfamethoxazole

Sulfadimethoxine

2.3.8 样品分析

75 200 500 75 200 500 75 200 500 75 200 500

90.72 99.85 99.74 111.86 113.13 92.48 95.59 74.31 92.20 80.68 71.73 103.43

4.2 1.9 5.1 5.3 6.2 5.3 12.4 4.3 2.6 9.1 6.2 7.9

86.00 98.28 97.94 109.30 106.47 93.39 95.64 72.55 87.93 79.28 73.62 105.07

5.3 2.1 5.6 7.9 5.8 6.0 12.7 6.3 6.8 7.7 9.6 8.4

为考察方法的适用性，在最优实验条件下检测市场上购买的3份牛肉样品，4 种磺胺类药物均未检测出残留。空白样品和加标样品的液相色谱图如图2.7所示，由图可知空白样品中无磺胺类化合物检出，并且在目标化合物的保留时间内无明显的干扰峰。为考察方法的稳定性，选取牛肉样品 1，对样品1进行不同浓度水平的加标分析，实验结果如表2.2所示，四种磺胺类化合物在不同的加标水平下的回收率为71.73 % ~ 113.13 %，回收率良好，该方法适合牛肉样品中磺胺类化合物的测定。

图 2.7牛肉空白样品（A ）及加标样品（B ）的色谱图

加标浓度为250 ng g-1，1-磺胺噻唑，2-磺胺甲基嘧啶，3-磺胺甲基异恶唑，4-磺胺间二甲氧嘧啶 2.4小结

本实验通过基质固相分散方法，建立了牛肉中4种磺胺类化合物残留的测定方法。实验考察了分散剂的种类、洗脱剂种类、洗脱剂用量、样品与分散剂质量比等影响基质固相分散提取的条件。实验结果表明，使用硅藻土作为分散剂，6 mL 甲醇用于洗脱目标化合物，1:4为样品与分散剂的最佳比例。本方法具有实验操作简单、样品处理时间短、提取效率高、实验成本低等优点。通过调整相应的MSPD 条件，该方法有希望应用到血液、肝脏等其它动物样品中磺胺类化合物的测定。 2.5参考文献

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