蛋白酶的筛选
蛋白酶的筛选
1、 取土壤，晾干，过40目筛，用无菌水梯度稀释至0.000001g土/1mL水
或0.0000001g土/1mL水，待用
2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板；配LB培养基或发酵培养基，灭菌，分作液体培养基，另外取一些倒斜面。
3、取1的融入土壤的水1mL涂平板，置于恒温箱，于50度或以上培养1～3天，挑选有水解圈（透明圈）的菌落用来划斜面（LB），于50度或以上进行纯化培养。
4、取纯化菌株，于液体LB中扩大培养。
5、离心，取沉淀，盐析，透析，得酶液。
6、以酪蛋白为底物，测酶液酶活，若酶活较大，则该菌株为你要的菌株了。
初筛1：用选择性培养基，把PH调低，则耐酸的才能活，另外，把N源去掉，加入酪素（酪蛋白），其他营养成分照基础培养基就行了，这样，产蛋白酶的菌种能将酪素分解成酪氨酸，就有可利用的N源，不产蛋白酶的菌种不能利用酪素，则没有N源，最后耐酸又产蛋白酶的菌种成为优势菌，挑出，换培养基。
初筛2：初筛1所得菌种用透明圈法（蛋白酶水解酪素产生透明圈，直径越大，酶活越高，具体步骤自己找）挑出蛋白酶活力高的菌种，接入摇瓶培养
复筛：初筛2所得菌以福林试剂法测酶活（以Folin染色，测吸光度，具体步骤自己找），酶活最高者为最终菌种。
一、
酪素培养基
成分：
酪蛋白 10g
牛肉膏 3g
磷酸氢二钠 2g
氯化钠 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液 12.5mL
pH7.4
制法：将除指示剂外的各成分混合，加热溶解(但酪蛋白不溶解)，校正pH。加入指示剂，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，倾注平板。
注：将菌株划线接种于平板上，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白。
二、
干酪素培养基(用于蛋白酶菌株筛选) 分别配制A液和B液。
A液：称取Na2HPO4·7H2O 1.07g。干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。 B液：称取 KH2PO4 0.36g，加水溶解。
A、B液混合后，加入酪素水解液0.3 mL, 加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1000mL。
酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL, 30℃水解lh。用于配制培养基时，其用量为1000mL培养基中加入100mL以上水解液。
三、酪蛋白培养基
KH2PO4 0．36g
Na2HPO4 ·12H2 O 1．3g
NaCl 0．1g
ZnSO4 ·7H2 O 0．02g
CaCl2 ·2H2 O 0．002g
酪素 4g
酪素水解氨基酸 0．05g
琼脂 15—20g
蒸馏水 1000ml
pH 7．0—7．2
先称取4g酪素，再加入0．5mol/LNaOH约2ml，将酪素溶解；然后依次加入其他药品，最后调pH7．0—7．2。0．56kg/cm2 (8磅/英寸2 )，112．6℃灭菌30分钟。