叶绿体蛋白的提取

一． 样品的制备

1. 样品的处理

（包括CK 和TRE ）用20% 的PEG-6000（渗透势大约为-1.88MPa) 诱导干旱胁迫（D ），直到它们的相对含水量达到83％-86％(一般3天) 。然后高温胁迫(H)处理在光照培养箱中进行，温度40℃，处理时间为24个小时（恢复0h:R0）。然后R 12，R 24，R 36，R 48。 DH 处理前，R 0，R 12，R 24，R 36，R 48：CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH; DH 处理后，取第3 片全展叶为试材，进行叶绿体蛋白组的分析。每个处理重复3 次。（CK,CK+TRE,CK+DH,CK+TRE+DH）

2. 叶绿体的分离

(1)剪取10g 小麦叶片，将叶片剪碎，液氮研磨；

(2)加入5倍体积4℃预冰冷的buffer A(buffer A ：50mM Tris-HCl ，20mM EDTA 0.5M蔗糖，0．25M Vc ，pH3.5) ，匀浆用8层医用纱布过滤滤液至预冷的50mL 离心管中，弃残渣。

(3)滤液1500g ／min ，15min 离心，弃上清，留沉淀。

(4)向沉淀中加入3mL bufferA，充分悬浮，转入10mL 离心管中。

(5)2000g／min ，15min 离心，弃上清，收集沉淀。

(6)加入2mLbufferB ，充分悬浮。(buffer B ：50mM Tris-HCl ，20mM EDTA ，0．5M 蔗糖，1％BSA ，7mM β-巯基乙醇现用现加)

(7)1500g／min ，离心10min ，弃上清，收集沉淀，再用bufferB 洗一次。

(8)同上离心，弃上清，再加bufferC 洗一次，离心，沉淀大部分为叶绿体。

(buffer C：50mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA，0．5M 蔗糖)

3.叶绿体的纯化

（1）制作不连续的percoll 密度梯度，先在超速离心管中加入3mL 的60％的percoll ，然后沿管壁缓缓加入4mL 的40％percoll ，最后加入5ml 20％的percoll 。 Percoll 浓度(％) 70 60 50 40 30 20 比重g ／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031 问：请问percoll 连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll 连续梯度? 答：根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll 本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll 与1份8.5％ NaCl或1.5M PBS 混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll 原液与10倍浓缩的PBS 以9：1的比例混合，此时溶液 为100％ Percoll，比重是1.127。

(2)将粗提出的叶绿体加入离心管中，8000g ／min 离心lh 。

(3)在20％和40％之间是一些密度较小的细胞器或破碎的叶绿体，在40％和60％之间是纯化的叶绿体，在试管底部还有一些沉淀。用注射器扎入40％和60％的界面，吸出叶绿体。

(4)加入等体积的bufferC(50 mM Tris-Hcl pH8．0，20 mM EDTA，0.5 M蔗糖) ，10000rpm 离心5min ，再用bufferC 洗一遍，沉淀即为纯化的叶绿体。

4.叶绿体纯度的鉴定

4．1显微镜观察

用bufferC 将叶绿体溶液稀释lO 倍，滴到载波片上，可见光下观察叶绿体形态、紫外线下观察叶绿素荧光，比较叶绿体和叶绿素荧光重叠程度。（荧光显微镜）

4．2特异酶检测

过氧化氢酶活性的检测：先用BCA 法测蛋白浓度，然后用过氧化氢酶检测试剂盒检测

5. 叶绿体蛋白的提取及溶解

(1)纯化的叶绿体(10g片) 加入1.5mL Buffer(100mM Tris，100 mM edta ，50mM borax，50mM Vc，1％TritonX-100，2％β-巯基乙醇，30％的蔗糖) ，将纯化的叶绿体剧烈悬浮，室温5min 。

(2)加入等体积Tris 饱和酚(pH8．O) ，剧烈震荡10min 。

(3)4℃，15000g 离心15min ，将上层的酚转移到新的试管中。

(4)加入5倍体积的硫酸铵饱和甲醇沉淀蛋白，-20℃，6h 。

(5)15000g，15min ，4℃离心。用冰甲醇洗一次，冰丙酮洗三次沉淀，每次洗涤15000g ，4℃ 5min，最终沉淀在空气中干燥。

6. 用BCA 方法测定蛋白浓度。

7. 双向电泳

7.1 IEF

7.2 SDS-PAGE

8. 双向电泳凝胶的固定及染色

将凝胶放入400 ml 固定液中固定3h 。超纯水振荡洗涤三次，每次20 min。加入400 ml预染色液，预染色l 小时。加入400 ml考马斯亮蓝染色液，染色3天。超纯水洗涤两次，每次5 min，10％冰乙酸水溶液中保存。

9. 差异蛋白比较和鉴定