白掌组织培养
一、实验目的
了解植物组织培养的方法,并掌握组织培养技术。
二、实验原理
植物组织培养技术是指在含有营养物质及植物生长物质的培养液中,培养离体植物组织(器官或细胞)并诱导使其长成完整植株的技术。所用的材料可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶,有时也利用花粉粒和花药,但根尖不易灭菌,一般很少采用。 对于木本花卉来说,阔叶树可在一、二年生的枝条上采集,针叶树种多采种子内的子叶或胚轴,草本植物多采集茎尖。白掌是多年生常绿草本观叶植物。
三、实验用品
1、仪器设备
培养室,高压灭菌锅,水浴锅,解剖刀,三角烧瓶( 100mL ),烧杯,量筒,组培瓶,组培盖或封口膜,棉线,接种箱或超净工作台,分析天平,长镊子,剪刀,容量瓶,移液管,牛皮纸。
2、试剂
70%的酒精、吲哚乙酸( IAA) 或 2 ,4 – D (生长素类似物)、 氯化汞(升汞)或次氯酸钠 、 6- 苄基氨基腺嘌呤( 6-BA ) 、 MS 培养基 、0.1 mol/L NaOH与 0.1 mol/L HCL
3、材料
白掌的幼嫩花序和侧芽
四、实验步骤
1.配制培养基
(1)愈伤组织诱导培养基:在 MS 培养基中加入10毫克/升6-苄氨基腺嘌呤和2毫克/升吲哚乙酸。 吲哚乙酸(IAA)先用少量 0.1 mol/L NaOH溶解, 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/LHCL溶解,然后用蒸馏水稀释,再加入培养基中。
(2)生根培养基:在MS培养基上添加2毫克/升吲哚乙酸
2.培养基灭菌
将配好的培养基加入琼脂加热溶解,调至 pH 5.8 ,趁热分装于 100mL组培瓶中,每瓶约 20mL。待培养基冷却凝固后,盖上组培盖,或盖上封口膜并用棉线扎牢,然后在高压灭菌锅中 121 ℃( 1 kg/cm 2 )下灭菌 20 min 。取出组培瓶放在台子上,冷却后备用。接种操作所需的一切用具(如长镊子、解剖刀、剪刀等)及灭菌水,需同时灭菌。 3. 制备外植体
将已消毒的材料,用无菌刀、镊等,在无菌的环境下,剥去嫩枝的外皮,然后切成0.2-0.5厘米厚的小片,这就是外植体。操作中严禁用手触动材料。
五、接种和培养
1.将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。
2.材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。接种过程中经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
3.用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上,每瓶接种4到10个。
接种后,用无菌药棉封口。
4.将接种过的愈伤组织诱导培养基放在保持在25℃左右培养室里培养40~45天,使其长出愈伤组织和不定芽;然后将其转入诱导生根的培养基中,也在无菌条件下操作,并在培养室里培养30~40天,成为完整植株。
六、组培苗的练苗移栽
试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境,必须进行炼苗。一般移植前,先将培养容器打开,于室内自然光照下放3天,然后取出小苗,用自来水把根系上的营养基冲洗干净,再栽入已准备好的基质中,基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫,加强水分管理,保持较高的空气湿度(相对湿度98%左右),但基质不宜过湿,以防烂苗。