食品中有机磷农药残留的几种检测方法比较_蔡建荣
中国卫生检验杂志2002年12月第12卷第6期 ChineseJournalofHealthLaboratory750
Technology2002.December.12.No.6
【述 评】
〔文章编号〕1004-8685(2002)06—0750—03
食品中有机磷农药残留的几种检测方法比较
蔡建荣 张东升 赵晓联
(江苏省微生物研究所,无锡 214063)
〔中图分类号〕R-331 R155.3+3 〔文献标识码〕 A
摘 要 简述了食品中农药残留的危害,综合叙述了国内外检测有机磷农药残留的方法包括微量化学法、色谱法、酶
抑制法、酶联免疫法等,并进行综合比较。
关键词:有机磷农药残留;检测;比较Abstract:Theauthorsnarratehazardousofpesticideresidualsimplyandthemethodsofdeterminingorganphosphorouspes-ticideresidualinourcountryandothercountries.Themethodsincludemicrochemistry,chromatograph,enzymeinhibition,im-munoassayetc.andcompareeachothenKeyword:Organphosphorouspesticideresidual,Determine,Compare1 农药残留的危害及对策
农药作为人类文明发展的产物,曾经为人类的粮食产量的提高做出过不可磨灭的贡献。随着人口的增加,人类对粮食的需求越来越大,为了盲目地追求粮食产量,减少粮食的损耗,人类在粮食生产、加工、仓储、运输过程中大量使用农药,与此同时大量使用农药后产生的环境危害也日益严重。
我国是世界上农药生产和消费大国,由于大量使用农药,我国农药中毒的人数也越来越多,1994年我国农药中毒人数有10万人。据卫生部的统计数字,2000年我国由于农药残留引起的食物中毒共37起,中毒1166人,死亡69人,占全年食物中毒人数的67%。有资料表明,随食物、水和空气进入人体的农药总量的百分比是,有机磷类农药为84%、10%和6%,有机氯类农药为93%、6%、1%,由此可见,通过食物进入人体的农药比例最高。人们从食物和水中获取生命必需成分的同时,几乎无一例外发现各种农药的高水平残留。这些农药残留通过食物链的作用,在人体累积而引起致畸、致癌、致突变等危害。世界各国已对这一问题高度重视,投入了大量资金,人力,物力和财力。如我国GB5127-85规定:粮食中的敌敌畏、对硫磷、马拉硫磷,限量标准分别为0.1ppm、0.1ppm、3ppm,果蔬分别为0.2ppm和不得检出,而要严格控制限量就必须有高效,准确,灵敏的检测方法来保证。随着我国加入WTO,我国与世界各国农产品的交易壁垒将被打破,要想我国的农产品在国际竞争中占有优势,其中严格控制农药残留就是一个非常重要的环节。
高毒、高效的有机氯农药现在己逐步被低毒、高效的有机磷农药取代,如DDT,666等已被禁止使用。加强对有机磷农药的检测方法和毒理研究,对保护生态环境,保障人类健康有着重要的意义。本文就国内外近年来对食品中有机磷农药残留的各种检测方法作一个综合比较。2 有机磷农药(0PS)的检测方法
有机磷农药是含有C-P键或C-0-P,C-S-P,C-N—P键的有机化合物,目前,正式商品有几十种,如敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷等。大部分有机磷农药不溶于水,而溶于有机溶剂,在中性和酸性条件下稳定,不易水解,在碱性条件下易水解而失效。有机磷农药主要是抑制生物体内的胆碱脂酶(CH-E)的活性,导致乙酰胆碱(Ach)这种传导介质代谢紊乱,产生迟发性神经毒性,引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹,消化道摄入,也可以通过皮肤、黏膜、呼吸道吸收而引发中毒。
根据有机磷农药的化学和毒理学性质,检测有机磷农药的分析方法有五大类:波谱法、色普法、酶抑制法、酶联免疫法以及活体生物测定法。2.1 波谱法 该方法是根据有机磷农药中某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色剂在特定条件下发生氧化、磺酸化、酯化、络合等化学反应,产生特定波长的颜色反应来进行定性或定量(限量)测定。检出限在微克级水平,见表1。
表1 各种显色反应类型及灵敏度显色反应类型二氧化钯法偶氮法间-苯二酚法
颜色黄色橙红色红色
灵敏度5-long5-10Dg1-5gg
有机磷农药类型含硫有机磷农药含硝基有机磷农药含氮有机磷农药
靛蓝法蓝色亚硝酰铁氰化钠法紫红色1-5gg含对硝基有机磷农药1—long含硫—磷键有机磷农药
表1反映的是微量化学试验法,主要用于商品农药的鉴别试验,灵敏度不高,试验干扰因素多,含不同基团的有机磷农药的反应也不一样,易出现假阴性。为提高灵敏度,用分光光度计等来测定有机磷农药的方法(即波谱法)逐渐代替了微量化学试验。AOAC规定了用红外光谱法检测敌敌畏、保棉磷、甲拌磷,用分光光度法检测马拉硫磷、对硫磷等。RasulianM对果蔬样品中的有机磷农药就采用分光光度法,检出量小于lg,回收率为94%。GarciaSancheF用分光光度法测定土壤中的有机磷农药,检出限为0.01eg,而RajuJ改进了有机磷农药的萃取方法,用反光光度法测定六种有机磷农药,检出限达nz级。
但波谱法一次只能测定一种或带相同基团的一类有机磷农药,且灵敏度不高,一般只能作为鉴别方法粗选,对含各种不同有机磷农药残留的样品还需用其他方法来进行确证试验。2 色谱法
2.1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱法是一种成熟的、应用也较广的微量快速检测方法。它在农药残留测定技术上有它独特的用处,它既是重要的分离手段,又是定性、定量的分析方法。它的特点是:
2.1.1 薄层上离析的理化过程,因不受物质的限定,故在方法的设计、拟定和实际应用上机动灵活,适合于对多种类型样品,多种农药检测。2.2 ,,复杂混分、
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不稳定物质的分离、相似化合物的离析和鉴定特别有用。2.1.3 薄层色谱的显色反应类型多,显色剂范围广。同一种农药一般有数种显色方法,同一种显色剂有时适应多种或一大类农药的显色反应,而且薄层吸附剂一般不受腐蚀试剂的限制,可根据样品性状和检测要求选择使用。2.1.4 薄层层析与仪器配合的联用(如扫描仪、光密度计等),则测定迅速,灵敏度高,重现性好,测试范围更宽。
2.1.5 薄层色谱原位斑点面积直接定量法,无需特殊设备和试剂,方法简易、快速、直观。
检测过程一般先用适宜的溶剂提取有机磷农药,经纯化浓缩后,在薄层硅胶板上分离展开,显色后与标准的有机磷农药比较Rf值进行定性测定或用仪器进行定量测定。测定过程大致归纳如下
:
在检测农药残留量时,原位化学显色技术的检出限一般在1~0.1μg,荧光显色技术(薄层扫描)在0.1-0.01μg,酶抑制技术可达0.01~0.001μg数量级水平。由于样品中农药残留成分复杂,含量又较低,为此,国内外针对该方法的不同实验步骤,如提取方法,纯化,浓缩方法,薄层板的吸附剂种类,展开剂的配制,展开方式(如单向和双向展开)以及显色方法都作了深入的研究和改进。ShennaJ.用C18柱固相萃取水中的有机磷农药,μgahkevich0.V用酶抑制显色的高效薄层色谱(HTLC)来检测马铃薯中的有机磷农药,检测限量提高到0.0l~5ng。2.2 气相色谱法(GC) 随着现代仪器分析方法的发展,气相色谱法已成为目前典型的,应用最广泛的仪器分析方法。在农药测定方面的应用主要是从六十年代开始的,可以这样认为,由于气相色谱的应用,特别是高灵敏度的选择性检测仪器的应用,农药残留量的测定水平提高到一个新的台阶。就在各种新的检测方法不断出现的今天,气相色谱法仍占绝对的优势,就是由过去的以填充柱为主转为目前的毛细管柱为主。由于石英毛细管柱的出现和进样系统的不断改进,大大提高了气相色谱法的分析精度、准确度和灵敏度,但气相色谱法对于挥发性差、极性和热不稳定性的农药分析较困难。AOAC对大部分有机磷农药,如乙拌磷、丰索磷、马拉硫磷、对硫磷,在八十年代就建立了气相色谱检测方法。我国食品理化检验国家标准方法也采用了气相色谱检测有机磷农药,检出限为lng。该方法是利用经提取、纯化、浓缩后的有机磷农药注入气相色谱柱,程序化升温汽化后,不同的有机磷农药在固相中分离,经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图,通过保留时间来定性,通过峰或峰面积与标准曲线对照来定量。一次可同时测定多组份,简便快捷,灵敏度高,准确性也好。而色谱条件的最佳设定是气相色谱技术的关键。日本学者O-muraU.研究了七种不同极性的固定相来分离检测不同极性的有机磷农药,检出限达0.05~10ng。MarbleLK.比较了萃取法和固相净化柱来纯化有机磷农药,认为0B—1柱能获得最佳效果。而ManesJ.用C18柱反相柱从水中分离浓缩有机磷农药得到很好的回收率。其他研究还报道了用凝胶渗透色谱法净化谷物、饲料中的有机磷农药残留,检出限达0.01—0.05ng。近年来毛细管气相色普法(CGC)得到了不断的发展和完善,使毛细管柱基本代替了原来的填充柱,不仅提高了灵敏度,分辨率和检测速度,而且稳定性,使用寿命都比填充柱优良。国外MiyabaraU.和JonogaiY.分别用电子俘获检测和火焰光度检测的毛细管气相色谱法测定了食品中几十种有机磷农药。而在国内,杨大进等报道了可同时测定大米中20种有机磷农药和6中氨基甲酸酯农药残留的毛细管气相色普方法毛细分离柑橘中7机磷农药残留量,比较了7种有机磷农药在柑橘不同生长时期的残留量情况,方法对7种有机磷农药的回收率83.5%-106.4%,RSD=3.0%-7.8%,检出限为0.1-20P-g/kg。另外陈泉、楼小华等也用毛细管气相色谱法分别检测了13种、25种样品中不同的有机磷农药,回收率和重复性都很好。目前,随着气相色谱仪的普及,对可能存在有机磷农药残留的样品如食品、果蔬、谷物、饲料、茶叶、水产品、土壤、植物材料、水体、以及血液、化妆品、羊毛脂、牛奶都建立了气相色谱检测方法。2.3 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法是在液相色谱柱层析的基础上,引入气相色谱理论并加以改进而发展起来的色谱分析方法。高效液相色谱法在农药残留分析的应用越来越广泛,是因为高效液相色谱法能适合分析沸点高而不太容易汽化、热不稳定和强极性农药及其代谢产物;且可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱等联用,易实现分析自动化;同时一些新型检测器的问世在一定程度上提高了高效液相色谱法的检测灵敏度。与气相色谱法相比,不仅分离效能好,灵敏度高,检测速度快,而且应用面广。AOAC中有近半数的有机磷农药都建立了高效液相色谱法,研究报道也很多,BrancaP·,SharpGJ.和BrayanJG.用高效液相色谱法分别测定了食品和水中,谷物及其制品,水稻中的有机磷农药。MartindaleR.W.比较了高效液相色谱法和气相色谱法测定马铃薯中的有机磷农药。不断改进的高效液相色谱法技术也扩大了高效液相色谱法检测有机磷农药的应用范围。MailetV.N.研究了7种不同的萃取方法提取环境中的有机磷农药用高效液相色谱法来检测。CarabiasR.采用紫外高效液相色谱法来检测水果中的有机磷农药。在国内,包宏等采用高效液相色谱法对西红柿中克线磷残留量进行检测,样品用等量无水Na2S04吸收水分后,用含1%磷酸丙酮对样品进行提取,用CH2C12在样品酸性和碱性溶液中进行萃取,以达到净化目的。采用ODS柱,以甲醇—水(30:70)为流动相,测定波长为250nm,方法最低检出量为lng,回收率为83.9%-91.4%,RSD为2.26%-4.37%。3 酶抑制法
有机磷农药对哺乳动物中毒作用的基础,通常与它们抑制中枢和周围神经系统的胆碱酯酶的能力有关。有机磷农药与乙酰胆碱酯酶的反应可用下列示性式表示(如下页图):式中EOH表示胆碱酯酶,0H是指活化中心丝氨基酸的羟基,AX为乙酰胆碱或有机磷等抑制性农药,X为留下的基团(如乙酰胆碱中的胆碱,对氧磷中的对硝基酚或西维因中的。一萘酚),符号A可视作乙酰基、二烷基磷酰基或甲氨基甲酰基。因此反应包括复合物(EOH·AX)的形成,接着是酶抑制作用,或乙酸化或程,或抑制了
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酶的活性,最后水解。磷酸化、乙酸化或氨基甲酸化了的酶是
非常稳定的,并能阻止酯酶对其他基质发生作用,这种作用取决于化合物对酶的“吻合”,以及化合物在酶的活性中心使丝氨酸或组氨酸氨基磷酸化的能力
。
由此可见,酶抑制法是利用有机磷农药的毒理特性建立的一种快速检验方法。由于有机磷农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性,使该酶分解乙酰胆碱的速度减慢或停止,再利用纸片或电极(即纸片法和膜电极法)作为载体将乙酰胆碱酯酶吸附在上面,如果酶的活性没有被抑制,生成了基质水解产物,使用呈色剂或发色的基质而显色。反之,如果被测样品中含有农药残留,则酶的活性被抑制,基质就不被水解,遇显色剂不显色。这样,通过纸片的颜色变化或电极的读数指示变化上可以测定有机磷农药与标准有机磷农药比较则可定量。AOAC早在1964年最早公布了该方法检测有机磷农药,美国1958年就研制出称之为酶片(En2ymeTicket)的商品来检测有机磷农药,灵敏度为0.1-10ppm。Sigma公司也有类似的检测试剂盒。国内李发生、朱曜分别报道了纸片法检测食品和出口冻牛肉中的有机磷农药,灵敏度为0.1-3.0ppm。国内也有生化公司正式生产和销售称之为农药速测卡的产品。
KulysF.研制了胆碱酯酶电流传感器,BernabeiM.用胆碱和乙酰胆碱电化学传感器检测有机磷农药,李发生也报道了利用酶传感器检测5种有机磷农药,最低检出浓度为1×10-12M。
酶抑制法最大的优点是操作简单,速度快,不需昂贵的仪器,特别适合现场检测以及大批样品的筛选,易于推广普及,但灵敏度比仪器法要差一些,重复性、回收率还有待提高。4 酶联免疫法(ELISA) 酶联免疫法是六十年代发展起来的一种新的检测方法,该方法起初主要用于病毒、细菌、蛋白等较大结构或分子的检测,应用范围主要集中于医学方面。七十年代后期,随着科技的发展,酶联免疫检测方法开始向检测生物毒素、农药残留、抗生素残留等小分子物质方向延伸。它作为一种新兴的检测农药残留的检测方法,肯定有它的优势和特点:4.1 灵敏度高,一般最低检测浓度为1μg/kg,如果应用单克隆抗体,检测灵敏度可达0.01μg/kg。4.2 检测过程操作简便快捷,一次可以检测多份样品。4.3 可进行定性或定量检测。4.4 安全性好。4.5 缺点是:4.5.1 特异性强,一种试剂盒只能检测一种有机磷农药,不能检测农药残留总量。4.5.2 有机磷农药分子只能作为半抗原,如果要制备抗体,要将有机磷农药分子与大分子蛋白结合后,再制备抗体,因而难度较大。4.5.3 易出现假阳性、假阴性的现象。
酶联免疫法虽好,但试剂盒商品化还有所欠缺,因为农药残留的品种很多,每一种农药就必须一种试剂盒,再加上抗体的制备难度大,费用高,所以国内还没有一家公司或科研院所经营和销售检测农药残留的试剂盒产品。但国外有许多公司有相关的酶联免疫试剂盒销售,例如Sigma公司。尽管如此,法检品中刘长武等曾经对水果中对硫磷的酶连联免疫方法检测作过研究,在将对硫磷还原为氨基对硫磷后,经重氮化反应与牛血清白蛋白或兔血清白蛋白联接,前者作为免疫抗原,后者作为包被抗原,测定水、梨和苹果时,最低检出浓度分别为3μg/kg,0.15μg/g,0.225μg/g,添加回收率均高于88%。在国外,针对大多数种类的有机磷农药残留的酶联免疫快速检测试剂盒都有出售,不过价格偏高。5 讨论
比较上述四大类检测方法,气相色谱法和高效液相色谱法是监测检验部门分析有机磷农药残留的主要方法,而薄层色谱和酶抑制法、酶联免疫法则更适合于基层单位的快速检测,各有所长。下面表2就各种方法的特点作一个综合性比较:
表2 各种检测方法特点比较
方法波谱法薄层色谱法气相色谱法高效液相色谱法酶抑制法
灵敏度1~long0.1~1μg0.05~lng
lng0.1~3.0ppm
分析时间分离组分/次分析过程
短长短短短短
单多多多无单
简单复杂复杂复杂简单简单
适用场合鉴别实验正常分析正常分析正常分析快速鉴定快速检测
酶联免疫法0.01~0.1ppb
另外,NishikawaY.和FranceJ.巳分别用超临界流体萃取
结合色谱法和酶抑制法来检测有机磷农药,提高了回收率。DurandG.用气相色谱—质谱(GC-MS)联用技术,BarceloD.用热喷雾高效液相—质谱(HPLC-MS)联用技术检测了有机磷农药。ChiranjecviP.用电位滴定检测了非水介质的有机磷农药,还有报道用直接光谱分析,毛细管区带电泳来检测有机磷农药的。随着电脑的普及,实验室自动化检测以及在线快速检测技术也得到了较快的发展。
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(收稿日期:2002-7-25)