6种乳酸菌降解胆固醇的体外试验

第26卷第6期

2005年 12月河南科技大学学报(自然科学版) Journal of Henan Universi ty of Science and T echnology (Natural Science) Vol. 26No. 6Dec. 2005

文章编号:1672-6871(2005) 06-0085-04

6种乳酸菌降解胆固醇的体外试验

刘丽莉, 董铁有, 杨协立112

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院, 河南洛阳471003; 2. 三门峡双洋商贸有限公司, 河南三门峡472000)

摘要:分析了6种安全的乳酸菌菌种在不同条件下接种于体外高胆固醇的MRS -CHOL 培养基中降解胆固醇的

情况, 以及培养液的p H 值与胆固醇降解率的关系。结果表明, 所用的6个菌种均可有效降解胆固醇, 依次为

Lp 菌(28. 088%) 、3#菌(25. 059%) 、4#菌(24. 922%) 、Lf 菌(24. 554%) 、Ld 菌(22. 248%) 和5#菌(18. 513%) ,

降解率随接种量的增加和培养时间的延长而增加, 除Lf 菌外, 其它菌株都随胆固醇浓度的变化而出现先升后

降的趋势, 培养液的pH 值与胆固醇的降解率呈负相关性, 且都不显著。

关键词:微生物; 乳酸菌; 胆固醇; 降解率

中图分类号:TS201.3文献标识码:A

0 前言

近年来, 国内外微生态学家发现微生物菌群中的乳酸菌、双歧杆菌以及肠球菌等与胆固醇的降解有一定的关系, 大量的体内外研究也证实了某些乳酸菌具有降低血清胆固醇含量的功效

[4][1~3]。为此, 人们对于乳酸菌降低胆固醇的机理进行了广泛的研究。对于降解机理相关报道有3种看法:(1) Gilliland

[5]等提出并证明了乳酸菌对于胆固醇具有同化作用。(2) 乳酸菌在胆盐的作用下与胆固醇产生共沉淀作用。(3) 现在人们大多倾向于同化作用和共沉淀作用的共同结果。但对于乳酸菌菌种体外胆固醇的降解能力的研究报道却很少。

本文将不同乳酸菌菌种接种于体外含高胆固醇的MRS -C HOL 培养基中, 研究各菌种在不同情况下对胆固醇降解情况, 并同时研究pH 值与胆固醇降解率的相关性, 从而为开发低胆固醇的发酵食品提供理论依据。

1 试验材料与方法

1. 1 试验材料

乳酸菌:来源于湖南农业大学食品科技学院微生物实验室, 从发酵酸辣椒、莴笋、菠萝中筛选出的3种乳酸菌分别简称为3#、4#、5#; 来源于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(CGMCC) 由农科院畜牧所提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus . casei ) 、植物乳杆菌(Lactobacillus . plantarum ) 、发酵乳杆菌(Lactobacillus . fermentium ) 分别简称Ld 、Lp 和Lf, 其藏号依次为1. 29, 1. 555, 1. 1880。

固体培养基:乳酸菌采用MRS 固体培养基, 成分配方按照文献[6]方法。MRS 液体培养基:不加琼脂, 其它成分同固体培养基。以上均采用121 灭菌20~30min 。MRSO -C HOL 选择培养基:在MRS 培养基中, 分别加入不同浓度的胆固醇胶束溶解液, 使浓度分别为0. 5、1. 0、1. 5、2 0mg mL 。

胆固醇:AR 级, 中国医药上海化学试剂公司; 胆盐:AR 级, 美国Sigma 公司; 蔗糖酯:生化试剂, 长沙食品添加剂公司; Fe NH 4(SO 4) 12H 2O :AR 级, 上海化学试剂公司。

1. 2 主要仪器设备

净化工作台(SW -CJ -IB 标准型, 苏州安泰空气有限公司) ; 高压蒸汽灭菌锅(XYQ. SG46. 28型, 辽宁化学仪器厂) ; 离心机(LD5-2A 型, 北京医用离心机厂) ; 分光光度计(722型, 上海第三分析仪器厂) ; 精密pH 计(pHS-3C 上海实验仪器厂) ; 移液枪(GILSON 公司) 。

基金项目:国家十五科技攻关资助项目(2001BA533C)

作者简介:刘丽莉(1974-) 女, 河南洛阳人, 讲师.

86

1. 3 试验方法河南科技大学学报(自然科学版) 2005年

(1) 乳酸菌菌落总数的测定。采用稀释平板计数法, 吸取100 L 样品, 无菌, pH=6. 8的PBS 缓冲溶液梯度(按1 10, 1 100, 1 1000 ) 稀释, 吸取合适稀释度的溶液100 L 于无菌培养皿, 倒入50 左右的灭菌MRS 琼脂培养基。立即混匀, 凝却后倒置厌氧培养, 38 培养36~72h, 观察菌落生长情况, 并计数。活菌数计数公式:cfu mL=平板菌落数 稀释倍数 10。

(2) 高胆固醇培养液MRSO-C HOL 的制备[8][7]。选择应用广泛的高胆固醇MRSO-C HOL 培养液作为体外菌株降胆固醇能力的培养液。1000mL 液体培养基中含1mg mL 胆固醇胶束溶液的制备:准确称量胆固醇0. 1g 放入小烧杯中 加入0. 2g 胆盐、0. 1g 蔗糖酯、1mL TWEEN-80搅拌均匀 再移取5mL 的冰乙酸加热溶解 把溶解液用超声波处理15min 后 快速加入到配制好的液体培养基中, 边加入边搅拌, 使其形成均匀稳定的胶体溶液。

(3)培养液基质中胆固醇的测定方法。采用血清总胆固醇测定和食品中胆固醇测定相结合的方法[9,10]。

硫酸铁铵显色剂:溶解4. 463g 硫酸铁铵[Fe NH 4(SO 4) 2 12H 2O]于100mL 85%磷酸中(可稍加热) 。取10mL 硫酸铁铵溶解液用浓硫酸稀释至100mL,

将此液放置于硅胶干燥器中备用。

胆固醇标准曲线的绘制:准确称取经过重结晶纯净过的胆固醇

100. 0mg, 溶于无水乙醇中, 并稀释至100mL, 再准确移取胆固醇溶液

10mL, 加入无水乙醇稀释至100mL, 充分混匀后的溶液即为胆固醇标

准液, 吸取胆固醇标准液0 0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2mL, 置于

25mL 带塞比色管中。在各管中加入无水乙醇使总体积达2mL, 再加

入2mL 硫酸铁铵显色剂, 加入时要沿管壁缓慢加, 使两液间保持明

显界面。加完后再充分振摇混匀(不能边加边摇) , 以便产生高热(>

图1 胆固醇标准曲线80 ) , 促进呈色。将各管放置10min, 待管内反应液冷却至室温, 在

30~60min 内, 于分光光度计560nm 波长读取各管吸光度值(A) , 并绘制标准曲线见图1。

取培养液0. 2mL, 放于15 100m m 离心试管中, 向试管内加入无水乙醇4. 8mL(注意:要缓缓滴加到试管中, 边加边摇, 以避免结块过大, 影响胆固醇的提取) 。置室温内10min 后, 以3000r min 离心沉淀5min 。另取16 150mm 试管, 用移液枪准确移取上清液2mL, 再加入2mL 硫酸铁铵显色剂溶液, 立即摇匀后, 冷却到室温, 在30~60min 内, 于分光光度计560nm 波长测定吸光度值。按测得的值, 从标准曲线查得相应的胆固醇含量。

(4) 胆固醇降解率的确定。按照比色方法测定培养基中胆固醇的含量, 以未接种的MRSO-C HOL 作为对照, 计算出各个试验菌株的胆固醇的降解率, 从中选出具有较好的降低胆固醇功效的菌株。

胆固醇的降解率/%=(C-A) C 100%

其中 A 为各实验菌株的发酵后的选择培养液OD 560n ; C 为空白对照的OD 560n m 。

(5) 不同菌种对降解胆固醇的影响。将供试乳酸菌活化扩大培养后, 分别转入5支液体试管培养基中, 适宜温度培养48h 后, 采用计数法测各管的菌体细胞数, 取相同细胞数量级的液体管中菌种, 按3%接种量接入到同时制备的含相同胆固醇胶束浓度的选择培养基中, 在适宜的温度下培养一定的时间后, 再定性和定量地测定胆固醇含量, 并与不接种空白组对照, 比较各菌种的胆固醇降解率。

8(6) 不同培养时间对降解胆固醇的影响。将乳酸菌菌株按3%的接种量(菌体浓度均为10个 mL)

接种于含1mg mL 胆固醇胶束的培养基中, 适宜温度下培养, 定时取培养液, 测定胆固醇的含量, 计算胆固醇降解率。

(7) 不同接种量对降解胆固醇的影响。考虑到菌株的应用及对发酵产品pH 值的要求, 最高接种量只能选择5%。将各菌株用无菌生理盐水稀释至10个 mL, 分别以不同的接种量:1%、2%、3%、4%、5%, 接种于含1mg mL 胆固醇胶束的培养基中, 适宜温度下培养3天后, 分别测定并计算胆固醇降解率。

8(8)不同胆固醇浓度对降解胆固醇的影响。将选育菌株按相同接种量(菌体细胞浓度都为10个 8

第6期刘丽莉等:6种乳酸菌降解胆固醇的体外试验 87 养, 培养时间均为3天后, 测定并计算胆固醇降解率。

(9) 选择培养液中pH 值的测定, 采用pH 精密酸度计直接测定[11]。

2

试验结果与分析

(1) 不同菌种对胆固醇降解的影响。供试的6种乳酸菌以

相同的3%接种量(菌体浓度为10个 mL) 接种于液体MRSO-

CHOL 培养基中, 38 条件下恒温培养72h 后, 测得的胆固醇降

解率的平均值如图2, 可以看出, 供试的6种菌株均可有效降解

胆固醇, 降解率最高在72h 时, 达32. 67%, 其中Lp 降胆固醇能

力最强, 降解率平均值为28. 088%, 其次为3#菌, 降解率平均

值达25. 059%。

(2)不同时间对胆固醇降解率的影响。将Lp 、Lf 、Ld 、3#、4图2 采用不同乳酸菌株时的胆固醇8

#、5#6种乳酸菌活化后, 取不同菌种相同的细胞数量级接种, 38 恒温培养, 定时测定的胆固醇的降解率见表1。可以看出, 胆固醇降解率随时间延长而提高。实验还发现, 培养3天后, 被试菌株对胆固醇降解率趋于稳定。因此在后面的培养时间确定为3天。

与C K 培养液相对照, 各试验组表1 不同时间培养液中胆固醇降解率都发生了降解, 而且随着时间的延

长, 胆固醇降解率都不断提高; 但培

养时间相同, 乳酸菌不同时, 胆固醇

降解率也不同。

(3) 不同接种量对胆固醇降解的

影响。不同接种量对胆固醇降解率

影响的试验结果见图3, 可以看出,

随着接种量的增加, 降解率也随之增时间 h [1**********]280

88Lp 10. 728. 7529. 8230. 1332. 8736. 4536. 4536. 46Lf 12. 1121. 9325. 3226. 1528. 9932. 8632. 8732. 89Ld 12. 9019. 7422. 7423. 4425. 8928. 9528. 9728. 993#18. 4320. 6922. 5725. 5629. 8533. 2633. 3033. 314#13. 5121. 9522. 8225. 7431. 3034. 2334. 255#10. 9814. 5516. 3420. 7622. 3826. 1226. 15%C K 0. 050. 090. 150. 180. 250. 360. 370. 4034. 2926. 16

大; 当接种量达到5%接种量时, 降

解率都达到各自最高值。对于各菌株而言, 在不同接种量条件下, Lp 菌株的降解率一直保持最高, 在接种量为5%时, 其降解率高达42. 54%。

(4) 不同胆固醇胶束浓度对胆固醇降解率的影响。胆固醇浓度对降解率影响的试验结果见图4, 可以看出, 在胆固醇浓度较低时, 除Lf 菌株的降解率随胆固醇浓度增大而不断降低外, 其它菌株的降解率都随胆固醇浓度的升高先增大后减低, 胆固醇浓度为1mg mL 时, 降解率最高, 高于此浓度时所有菌株

的胆固醇降解率都呈现下降趋势。这可能与高浓度胆固醇对微生物菌种有抑制作用有关。

图3

胆固醇降解率随接种量的变化图4 胆固醇浓度时胆固醇降解

(5) 培养液的pH 值与胆固醇降解率的相关性。在测定培养液中胆固醇含量的同时, 还定时测定培养液的pH 值, 由测定结果可知, 随着培养时间的延长, 各菌种培养液的pH 值都在变小。胆固醇降解率与培养液pH 值相关性的试验结果见表2, 可以看出, 随着胆固醇降解量的增加, 培养液的pH 值呈下降; ,

88

能无关或关系不大。河南科技大学学报(自然科学版) 2005年

表2 胆固醇降解率与培养液pH 值的相关性菌株类型

Lp

胆固醇降解率/%

12h 的p H 值

相关系数

胆固醇降解率/%

24h 的p H 值

相关系数

胆固醇降解率/%

36h 的p H 值

相关系数

胆固醇降解率/%

48h 的p H 值

相关系数

胆固醇降解率/%

60h 的p H 值

相关系数30. 613. 6127. 384. 8530. 133. 7126. 954. 9829. 823. 8626. 655. 0128. 754. 3521. 935. 1910. 75. 07Lf 12. 115. 24Ld 12. 905. 11-0. 4952819. 744. 80-0. 1887322. 564. 21-0. 0557923. 444. 19-0. 1111125. 894. 11-0. 4611829. 853. 7831. 303. 7522. 384. 0925. 564. 0225. 744. 0120. 764. 1122. 984. 0922. 824. 1317. 584. 3620. 694. 3021. 954. 1714. 554. 563#18. 434. 694#13. 514. 675#10. 984. 77

3 结论

(1) 供试的6种乳酸菌菌株均可有效降解培养基中的胆固醇, 其中植物乳杆菌效果最好, 其次为酸辣椒乳杆菌、莴笋乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌和菠萝乳杆菌; 随着培养时间的延长, 胆固醇降解率不断提高, 培养72h 时, 植物乳杆菌的降解率可高达32. 67%。接种量增加, 胆固醇降解率也随之上升, 期间植物乳杆菌菌株的降解率一直保持最高, 在接种量为5%时, 降解率高达42. 54%。

(2) 在胆固醇浓度较低时, 除Lf 菌株降解率随胆固醇浓度升高不断降低外, 其它菌株的降解率都随胆固醇浓度的升高先增大, 当胆固醇浓度高于1mg mL, 降解率又呈现下降趋势。

(3) 在发酵过程中各菌株胆固醇的降解率与培养液pH 值的变化呈现负相关性, 但都不显著, 表明乳酸菌对胆固醇的降解与环境pH 值可能无关或关系不大。

参考文献:

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No. 6CONTENTS AND ABS TRACTS (70)

1121MA Bing , LI ANG Bin , GAN Xin -Min , ZHANG Ping (1. Architectural Engineering College , Henan University o f Science &Technolo gy , Luoyang 471003, China ; 2. China Petroleum First Corporation , Luo yang 471023, China )

Abstract :Research and applications of steel reinforced concrete (SRC) transfer beams of high -rise buildings are summarized. Distinctive features of stress and deformation, and of structural construction methods of the SRC transfer bea m are analyzed. On the basis of the summary of research and design methods, it is indicated that the research on the relationship between transfer beams and their upper shear wall can be expected to be enhanced.

Key words :High building; SRC; Transfer beam; Stress and deformation; Efeatures; C omputational methods

CLC num ber :TU311 Document code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0070-04The Present Research and Prospect of Performance -based Seismic Design Theory (74) BAI Xiao -Hong, B AI Guo -Liang (College o f Civil Engineering , Xi an University o f Architecture &Technology , Xi an 710055, China )

Abstract :This paper depicts the directional stages of modern earthquake resistant design theory including the background, development and research contents of each theory. Performance -based seismic design theory and methods are a revolution in current seismic design procedures, with extensive attentionnow being paid by international academia and engineers. Although the basic framework of this theory is being shaped, the supportive data are scarce. Some indicies need to be standardised so that the the ory will have stronger operational ability.

Key words :Earthquake; Fortification against earthquake; Earthquake resistant design; Seismic design approach

CLC num ber :TU435 Document code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0074-04

Agricultu re and Biology

Photoprotective M echan isms of Plant Grown in High Light Intensity Environment (78) YI Xian -Feng, YANG Yue -Qin (College o f Agriculture , Henan University o f Science &Technology , Luoyang 471003, China )

Abstract :Due to special living c onditions of low temperature and intense radiation, plants are easily subjected to photo -oxidation. However, series of photo -protective mechanisms can lessen or even elimina te photo -oxidation, reflecting the adaptation of plants to the high light intensity environments. Mechanisms of photo -protec tion and avoidance of photo -inhibition are summarized based on recent studies on plant photosynthetic acclimation to high light radiation environments.

Key words :Plant; High light intensity; Photo -inhibition; Photo -oxidation; Photo -protection

CLC num ber :S4 Document code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0078-04D irect Som atic Embryogenesis and Plantlet Regeneration from Immature Z ygotic Embryos of Citrus

(82)

12ZHANG Jian , LU Liu -Xin (1. College o f Li f e Sciences , Fujian Agriculture &Forestry University , Fuzhou

350002, China ; 2. College o f Horticultural Sciences , Fujian Agriculture &Forestry University , Fuzhou 350002, China )

Abstract :Using immature zygotic embryos of Citrus as explants, primary somatic e mbryogenesis in vitro was direc tly induced with high frequency, and plantlets were regenerated. A preliminary regeneration system was established in this study. The results showed that the induction frequency of directly induced soma tic embryos is highest when immature zygotic embryos are cultured on MS medium supplemented with 1mg LI AA and 20mg LBA.

Key words :Citrus; I mmature zygotic E mbryo culture; Somatic embryogenesis

CLC num ber :S666. 035 Document code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0082-03Research on LAB Degrading Cholesterol (85)

112LI U L-i Li , DONG Tie -You , YANG Xie -Li (1. Food &Bioengineering College , Henan University o f Science &, ,

Journal of Henan Universi ty of Science and Technology(Natural Science) 2005Abstract :In this study 6types of safe lactic acid bacteria were inoculated with high MRS -C HOL culture, whose cholestero-l degrading abilities had been tested. The relation between pH value and rate of degrading of cholesterol were studied. The results indicate 6strains have different rates of cholestero-l degrading:Lp(28. 088%) , 3#(25 059%) , 4#(24. 922%) , Lf(24. 554%) , Ld(22. 248%) , and 5#(18. 513%) respec tively. The rate of cholestero-l degrading increased with incredsing quantity of inoculant; All the strains except Lf present the tendency of rising then falling with increasing the density of cholesterol. While there was a negative correlation between pH value and the rate of cholestero-l degrading, the correlation was not significant.

Key words :Mic roorganisms; Lactic acid bacteria; Cholesterol; Rate of degrading

CLC num ber :TS201. 3 Document code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0085-04

Mathematics and Physics

Exact Solutions of a Coupled Schr dinger Equations with a Quadratic Nonlinearity (89)

111, 2GAO Ke -Quan , Z HANG Jin -Liang , WANG Ming -Liang (1. Science College , Henan University o f Science &

Technology , Luoyang 471003, China ; 2. Department o f Mathematics , Lanzhou University , Lanzhou 730000, China ) Abstract :B y means of traveling wave reduction method, the solitary wave envelopes of the coupled nonlinear Schr dinger equations with quadratic nonlinearity describes the propagation of the slo wly varying envelopes under conditions for noncritical phase matching in nonlinear fibres.

Key words :Nonlinear Schr dinger equation; Traveling wave reduction method; Solitary wave envelope

CLC num ber :O175. 2 Document code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0089-03

Chemistry , Chemical Eng ineering and Others

Simu lating Com puting of Hunan Electric Power System (92)

11123LI U Yang -Hua , LI Xin -Nan , LI N Shun -Jiang , C HE N Feng , SHI Wen -Hui (1. College o f Electrical &

In formation Engineering , Hunan University , Changsha 410082, China ; 2. South City Power Supplying Com pany , Changsha 410000, China ; 3. College o f Electrical &Information Engineering , Xi an Jiaotong University , Xi an 710049, China )

Abstract :B y adopting different model structures and changing their parameters, the authors studied the actual effec t of several classic load models on the transient stability of the Hunan electric power syste m. In the process of comparison, the authors considered mechanism connection between different load models to guarantee comparison consistency. Results of systema tic exa mination showed that the deadline time of system stability simulation for a 3-step IM model with an Xs of 0. 295is much shorter than those of other models. User -defined models were added into the PSASP to get a clear result. This research is of reference value for power syste m modeling simulation. Key words :Power system; Transient stability; Load; Model; Simulating computation

CLC num ber :TM714 Documen t code :A Article ID :1672-6871(2005) 06-0092-04Present Situation And Development of Optimal Operation Study of Pumping Station in China

(96)

1, 3231JIA Ren -Fu , JI NG Ming -Yu , W ANG Hong , C HE N Shou -Lun (1. College o f Water Conservancy &Hydro power Engineering , Hehai University , Nanjing 210098, China ; 2. Nanjing Program ming &Design Institute o f Water Conservancy , Nan jing 210098, China ; 3. College o f Architectural Science &Engineering , Yangzhou University , Yangzhou 225009, China )

Abstract :With the development of pumping station, the study of the optimal operation of pumping station is increasing. The research on the optimal operation of single and mult-i step pumping sta tions is briefly analyzed, and a summary of the application of systems analysis, neural networking and fuzzy theory in the optimal operation of pumping stations is also introduced. The existing proble ms of national researches on pumping optimal operation are analyzed. It is predicted that fuzzy theory, gray system theory and neural networking will be further applied to the field of pumping stations optimal operation.

Key words :Irrigations pumping station; Mult-i sta ge pumping stations; Optimal operation A :