2,4-D降解菌
2,4-D降解菌生物学特性研究
摘 要:本论文即研究2, 4- D降解菌的分离与降解特性。首先使用2, 4- D为唯一碳源的培养基,从受污染土壤中筛选特性菌。采用液体培养基,在28℃及150 rpm的恒温摇床下培养,通过每24h测定菌浊度与2, 4- D浓度得到各特性菌的表观降解率。而后,选择特性菌研究不同pH与2,4-D浓度下特性菌降解率及菌浓度的变化,结果表明特性菌的最适pH在7-8之间,而高浓度2,4-D对菌的生长产生抑制,并降低其降解率。最后,试验研究了混菌之间的交互作用。结果表明2,4-D降解菌之间协同代谢较少,而拮抗竞争较多。
关键词:2, 4- D;土壤污染;微生物降解
The Biological Characteristics of 2,4-D Degradation Bacteria
Liu Jingbo Tutor: Wei Yahong
Abstract: This paper focused on the isolation and degradation characteristics of 2,4-D degradation bacteria. Firstly, we used 2,4-D as the only source of carbon in the cultural medium, 6 degradation bacteria were isolated and screened from the polluted soil samples. After shaking at 28℃ and at 150r/min on the liquid cultural medium we got the apparent degrading rates by studying the bacteria density and 2,4-D concentration each 24h. Then we choose 2 bacteria to study the changes of bacteria density and degrading rates in different pH and 2,4-D concentration. The experiment has proven the bacteria most suitable pH was 7-8, and high 2,4-D concentration could have the suppression to the bacteria growth, and reduces the degeneration rate of characteristic bacteria. We also studied the interaction between 2 kinds characteristic bacteria. There is more antagonism than to enhance the degradation characteristics.
Keywords: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, soil contamination, micdegradation
1 前言
1.1农药发展
农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草害等有害生物,以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学药品,或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。人类很早便开始使用一些天然存在的物质作农药,如我国古代利用烟叶浸水后的汁液杀虫等。但大规模使用农药还是上世纪以后,随工业社会的发展而出现的,据统计在1960年到1990年这三十年间,在全世界的农药销售额,由8.5亿美元增加到234亿美元,增长极为迅速【1】。
现代化学农药只有半个世纪的历史,然而它的使用在促进农业的发展中发挥了极重要的作用。
石元春院士曾提到,全世界农业平均每年增产在20世纪上半叶1.4kg/hm2;而下半叶这个数字达到43.0kg/hm2,并认为增产幅度中总技术贡献率占73%,其中育种技术占3成,水利和灌溉占2成,农业化学品(主要就是化肥和农药)占5成。
我国农药的生产使用经历了50年代的砷、铅汞制剂,60~80年代初有机氯农药以及其后至今的各类取代农药等3个发展阶段。我国常年病、虫、草、鼠害发生面积2.3-2.67亿hm2,因此采取措施控制有害生物显得尤为重要。而化学农药的发展为控制有害生物,促进我国农业的进步做出不可磨灭的贡献,如1956年开始制定的《全国农业发展纲要》曾列出包括蝗虫、水稻螟虫、小麦吸浆虫、棉红铃虫等害虫在内的11大病虫害,其中绝大部分是靠化学农药解决【2】。
与生物防治、物理防治等其他植保措施相比,使用现代化学农药控制农业有害生物的化学防治具有适应面广、操作简易、规模巨大、作用快速、效果显著等优势,特别是当某种有害生物即将暴发成灾之时,化学防治往往是唯一可选择的有效措施。
但随着化学农药的大量使用,一系列的危害也表现出来,早在上世纪60年代,Rachel Carson在silent spring 一书中就指出滥用农药所带来的一系列危害,为世人敲响警钟。
1.2 农药污染[3,4,5]
总体上可将化学农药的危害分为两个方面,即对靶标植物和植物产品或其它植保目的的危害,和因进入生态系统循环而对农药使用者、消费者或进而整个生态系统的危害。具体表现为:
1.2.1 对大气的污染
农药可以通过喷雾中的飘移和由土壤和水中挥发而进入到大气中 , 并随着大气的运动而扩散 , 使大气污染的范围不断扩大,而在空气中的农药可以飘得很远。人们在喷洒农药时,很容易呼吸到飞散在空气中的农药。
1.2.2对土壤的污染
土壤是农药在环境中的“贮藏地”,又是农药在环境中的“集散地”。土壤中的农药,既有为控制有害生物而直接施入,也有因浸种、拌种等施药方式而造成的污染。农药残留在土壤中最重要的效应便是对土壤中的微生物、原生动物以及其它的节肢动物、环节动物、软体动物等产生的影响,并进而危害土壤生态系统。
1.2.3对水质的污染
农药可以通过从土壤表面的流失而进入水环境,农药加工厂的工业污染排放、生活污染水等可能使农药进入水体。农药进入水体后对各类水生生物都将产生一定的影响 , 从而可能破坏水体生态系。比如被水冲进水源里的农药降低或增加了水体的酸度,使得水生生物大量死亡或导致大批繁殖。造成了当地鱼类的饵耳不足,或是使水体富营养化严重,含氧量下降,导致水生生物窒息死亡。渗入地表深处的农药污染了地下水,进而污染了井水、河水等饮用水源。
1.2.4对动物的影响
昆虫、鸟类、哺乳动物等都会因为直接喷洒药、土壤或水中的农药及食物中的农药而受到损害。主要表现在,导致害虫抗药的产生,害虫的再猖獗,原来的次要害虫上升主要害虫,破坏生态平衡,是自然生物防治能力削弱从而使农业生态系统更依赖农药。
1.2.5 对人类健康的影响
环境中的农药可通过消化道、呼吸道和皮肤等途径进入人体,产生各种危害:急性毒作用,慢性毒作用,在人体内蓄积,对酶类、神经系统、内分泌系统、免疫功能和生殖机能的产生影响,导致致畸、致突变和致癌作用。比如农药对神经系统的作用,主要是有机磷农药的作用。有机磷农药急性中毒,会引起患者中枢神经系统功能失常,出现共济失调、震颤、思睡、精神错乱、抑郁、记忆力减退和语言失常等。
1.3我国现阶段农药危害特点[4,6]
20世纪90年代中期以来,我国农药年生产量超过50万吨,2001带到69.6万吨,使用量也达到40万吨以上,平均用量为2.33kg/hm2,并有从西向东、从北到南逐渐递增的趋势。同时使用的农药有 80%~90%将流失到土壤、水体及空气中,10%~20%残留在农作物上。农药危害已很严重。
我国早期的砷、铅、汞制剂及有机氯农药已分别于 70 年代初和 1983 年起陆续停止使用,但由于有机氯农药性质稳定故残留期较长,在相当长时间内仍对环境有一定危害。随着有机氯农药的禁用,我国也研制及引进了许多高效低量、低残留的农药,但有些农药的毒性却比有机氯农药增加了十倍乃至百倍,如有机磷、氨基甲酸酯。总体上看 ,目前我国农药对生态环境的影响与作用直接危害后代健康 。
目前我国农药对生态环境的影响危害有这样一些特点:
急性中毒和环境污染事故频繁发生,事故呈局部性、突发性和危害严重性。产生危害的农药以高毒、具潜在毒性和高效、超高效农药为主污染,这是由于我国取代有机氯等长残留农药的多具有易降解、残留期短、剂量低、毒性强、效率高的特点。
另外,农药还对生态环境和人体健康具有潜在危害和长期环境效应,表现在 “三致”效应与环境激素效应、对生态平衡与生物多样性的影响、多次施药与复合污染的影响。以环境激素来讲,化学农药是主要的环境激素 ,进入动物和人体内后会干扰内分泌 ,使生殖机能异常。另外还有所谓化学定时炸弹即农药结合残留,尽管我国采用了低残留农药,但这些农药还是会有相当一部分与土壤形成结合残留物,而这些长期储存于土壤中的结合残留农药一旦被活化后突然释放出来将产生难以预计的有害效应。
总之,农药污染已严重危害我国农业可持续发展,进而威胁我国生态环境。减轻或消除农药污染有很多种方法,比如研制更具安全性的农药,发展生物防治技术,对农民教育以更恰当、安全的方式使用农药。而使用生物修复技术对受污染区域进行治理,日益发挥重要作用。
1.4生物修复
生物修复是指利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物的浓度或使其完全无害化, 从而使污染了的土壤环境能够部分地或完全地恢复到原初状态的过程,也被称为生物恢复、生物再生。生物修复的基础研究始于20多年前,早期研究集中在水体、土壤和地下水环境中的石油生物降解,80年代以后被实际应用与大范围污染环境治理,并取得成功。比如JonE.Llidstrom等人在1990年夏到1991年应用投加营养和高效降解菌对阿拉斯加Exxon Valdez 王子海湾由于油轮泄漏造成的污染进行的处理,取得非常明显的效果,使得近百公里海岸的环境质量得到明显改善[7]。
生物修复可分为原位生物修复与异位生物修复两种,原位修复是指对受污染的介质不做转移而在原位进行修复,其修复作用主要依赖于被污染环境土著微生物的自然降解
能力及人为创造的适宜降解条件。异位修复则将受污染介质移到他处进行处理,更强调人为控制与优化降解环境。
按所用生物不同,可分为植物修复、动物修复和微生物修复。植物修复技术以植物忍耐和富集某种或某些有机或无机污染物为基础,利用植物划植物与微生物的共生体系,清除环境中污染一门环境污染治理技术[8]。目前,植物修复技术主要运用在土壤重金属污染治理方面。而对有机农药污染的研究较少,植物对农药污染的修复可分为三种机制,植物直接吸收和降解,植物释放酶的酶解作用,以及根际—位生物量和代谢作用
[9]。实验表明辛醇水比在0.5 —3.0之间的化合物易于被植物吸收。而一旦被吸收,便能能被代谢、储存(一般在根系) 或挥发掉[10]。并表明植物会影响可阴离子化的农药2 ,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 的吸附、解吸附以及降解行为,从而改善土壤中这两种农药的生物可获得性。而植物修复污染土壤技术今后需要特别注意研究的领域为:植物种的特殊性;根际其他因子的动态以及土壤基质中有害物质通过代谢从土壤中转移到植物组织的过程是否为有毒害物质的累积过程[11]。总之,在生物降解过程中,植物会给微生物降解提供有利条件,起到促进作用。
动物修复在国外有较长的研究史,国内的研究还处于摸索阶段农药的动物修复指利用土壤动物生理代谢作用消除农药污染。如土壤中的一些蚯蚓鼠类等大型土生动物,能吸收或富集土壤中的残留农药 ,并通过其自身的代谢作用 ,把部分农药分解为低毒或无毒产物。而土壤中丰富的小型动物种群 ,也对土壤中的污染农药有一定的吸收和富集作用 ,可以从土壤中带走部分农药。
相比之下,微生物修复研究得最多。是利用微生物生理代谢作用而减轻或消除污染。一般方法有在受污染地点创造适宜环境加速自然降解,在污染点接种降解率高菌株。微生物种类繁多,生理类型、代谢方式也多种多样,且具有分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异等特点。为利用微生物进行污染修复提供了物质基础。人们既可以人工筛选自然界存在菌株,也可运用基因工程的现代生物学技术,制造“超级菌” [12]。
微生物对农药的降解主要通过其分泌的酶来反应,本质为酶促反应。包括光谱性酶的偶然性代谢;基质结构与农药相近的酶进行的共代谢;利用农药作为能源适应酶的降解性代谢。主要有水解酶与氧化还原酶。主要降解途径有:水解(hydrolysis),脱卤(dehalogenation),氧化(oxidization),硝基还原(nitroreduction),甲基化(methylation),去甲基化(demethylation),去氨基(deamination),轭合(conjugation)。
目前为止,人们已分离了许多可降解农药的微生物,其范围涵盖细菌、真菌、放线菌和藻类。其中,对细菌的研究较为深入,其次是真菌。在这些微生物中,往往一种微生物可降解多种农药,较具代表性的有细菌中的假单胞菌属( Pseudomonas ) 可降解DDT、γ-BHC、艾氏剂、毒杀芬、马拉硫磷、二嗪农、甲拌磷、敌敌畏、甲基对硫磷、西维因、2 ,4-D、二甲四氯、茅草枯、地乐酚、灭草隆、西玛津、环草隆、三氯醋酸、氯苯胺灵等[13]。而一种农药也可被多种生物降解。具体见下表:
表1 降解微生物种类[14]
影响微生物降解的因素可分为三方面:
A 农药本身的物理性质
包括农药内部化学键、浓度、水溶性、分子极性等。到目前为止,还没有发现那一种微生物可以降解所有的农药。一般而言,农药生物修复的难易程度与农药的化学结构密切相关,结构简单的农药较易降解,结构复杂的则较难降解;分子量小的农药比分子量大的农药较易降解;难溶于水的农药比易溶于水的农药难降解。
B 微生物自身降解能力和活性
一般而言,土壤中微生物数量巨大、种类繁多,很多受污染地点本身就存在可降解农药的微生物种群。并且在长时间接触污染物后,自然选择会使土著微生物产生降解变异。土著微生物可较适应当地环境,故在目前相当多生物修复工程中得到应用。此外,还可以分离筛选高效降解菌,以及利用现代生物学技术的发展使构建基因工程。需要注意的是接种的高效要接受但地环境的考验,又要与土著微生物竞争,其效应很复杂,这也是一些在实验室表现高降解性的菌种在外界环境却无法表现的原因之一。
C 环境因子
环境因子对农药生物修复的影响是巨大的,这些因子包括温度、湿度、酸碱度、营养、金属浓度等,这些因子的影响有时甚至决定了农药生物修复的成功与否。
目前生物修复虽仍受农药种类、环境条件等多方面限制,效率不高。并且生物修复中所使用的微生物可能会污染地下水,或引起植物发病, 繁殖过量有时会堵塞土壤的毛细孔,影响植物对土壤水分的吸收而微生物对农药所具有的降解能力有时会造成农药防治上的困难,导致药剂失效,防治失败。而基因工程菌所带来的基因污染问题也引起部分人的担心。但生物修复具有安全、高效、节省费用应用范围广等优点,一定会在将来发挥重要作用。
1.5 2,4-D的基本性质、危害与目前降解研究
1.5.1基本性质与作用
2,4-D全名为二四二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)为人工合成的植物生长素类调节剂[15]。分子式为C8H6O3Cl2,相对分子质量约221.04。高浓度实施可用于除草剂。1941年美国人R.波科尼发表了2,4-滴的合成方法,1942年P.W.齐默尔曼和A.E.希契科克首次报道2,4-D用作植物生长调节剂。1944年美国农业部报道了2,4-D的杀草效果。后因其用量少、成本低而一直是世界主要除草剂品种之一[16]。纯2,4-D可以片状、粉状、晶体粉末和固体等形式存在,白色略带棕褐色,略带酚的气味。熔点140.5℃,不吸湿,有腐蚀性。25℃时在水中的溶解度为620mg/L,可溶于大多数有机溶剂,但不溶于苯和石油 其酯类溶于油。2, 4- D的盐溶解度稍大。属低毒性植物生长调节剂。
低浓度2, 4- D可作植物生长调节剂,其在提高座果率、增大果实,果实保鲜,促进植物生根、调节细胞生长,诱导根瘤的形成,抑制肿瘤等方面有重要作用[17]。高浓度则是广谱的除草剂,单子叶的禾本植物对其一定的耐受力,双子叶的阔叶植物对其非常敏感,利用这种选择性,可用于水稻、麦类禾本科作物田间防除阔叶杂草[18]。
1.5.2 残留及危害
2,4-D属低毒物质,但由于其不易分解,水溶性低 ,故进入自然环境中后会发生累积,使浓度增大而产生危害。如影响土壤微生物种群的生长。和文祥等[19]开展了农药与土壤酶关系的研究, 通过室内模拟试验, 研究了2, 4- D 对土壤酶活性的影响,证实2, 4- D可显著降低土壤脲酶的活性。为有机氯生物毒性和生物可利用性提供了新的证据。作为植物生长调节剂,2, 4- D会影响植物的正常营养运输,导致植物某些部位营养不良。会产生果实畸形、幼叶畸形、植株畸形。人则可以通过吸收、摄食或皮肤接触而被侵入体内,但毒性表现温和[20],但对眼睛、皮肤的刺激作用,反复接触对肝、心脏有损害作用,能引起惊厥。世界卫生组织也将含氯苯氧羧酸类除草剂( 包括2, 4- D) 定为潜在致癌物。
1.5.3 降解研究
因为2, 4- D的这些危害,人们对其降解研究很多,如在自然环境中的空气,水以及土壤中的降解,表明空气中挥发性在2, 4- D的分解和消散中的作用很小;而在水环境中2, 4- D的酯水解成阴离子,水解速率与pH值有关;在土壤中降解的主要路线是微生物降解和光降解。具体见下图:
图1 2, 4- D的降解[21]
此外,2, 4- D施用后在植物体内的降解代谢变化也是研究重点。2, 4- D经常用作柑橘保鲜剂,任志华等对2, 4- D处理后的罗岗甜橙果实后的降解做过研究[22],整体而言,在各种植物中有几条2, 4- D降解途径是很明显的(见图2),代谢的主要途径包括侧链降解、环的羟基化作用、共轭反应以及合并为生化药剂或植物的生化基质。
图2 2, 4- D在植物中的降解途径[23]
目前对于2, 4- D 的降解,其高级氧化技术研究较多,包括电离辐射[24]、光降解[25]、电化学[26]、臭氧化[27]等方法。此外,微生物由于其代谢形式多样,反应条件温和,不易造成二次污染等优点而成为2, 4- D降解的选择之一。本论文即通过筛选降解菌种,测定降解率并测试不同条件对菌降解率的影响研究微生物对2,4-D的生物修复。
2 材料和方法
2.1 试剂
二四二氯苯氧乙酸,上海市四赫维化工有限公司,其2, 4- D含量不小于98%
2.2 仪器
7230G以及22PC型可见分光光度计(测定菌浊度),KDC40低速离心机,752N型紫外分光光度计(测定2, 4- D浓度),摇床
2.3 培养基
2.3.1 培养基Ⅰ(空白对照无碳源[23])
NH4NO3 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g, K2HPO4 1g, Agar 16g, H2O 1L
2.3.2 培养基Ⅱ(有机氯农药2, 4- D作为碳源之一)
NH4NO3 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, NaCl 0.5g , FeSO4·7H2O 0.01g, K2HPO4 1g, Agar 16g, 2, 4- D 0.3g, 酵母膏 0.2g, H2O 1L
2.3.3 培养基Ⅲ(有机氯农药2,4-D为唯一碳源)
NH4NO3 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g, K2HPO4 1g, Agar 16g, 2, 4- D 0.5g, H2O 1L
2.3.4 培养基Ⅳ(富集培养基)
葡萄糖 0.5g, 蛋白胨1g, K2HPO4 1g, 2, 4- D 0.3g, H2O 1L
2.3.5 培养基Ⅴ(纯化培养基)
NH4NO3 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g, K2HPO4 1g, Agar 16g, H2O 1L
2.3.6 培养基Ⅵ(保存培养基)
蛋白胨 10g, 酵母膏 10g, NaCl 5g, 2,4-D 0.5g, H2O 1L
2.3.7 培养基Ⅶ
NH4NO3 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g, K2HPO4 1g, 酵母膏 0.5g, 2,4-D 0.5g, H2O 1L
2.4 试验方法
2.4.1 菌株的富集
配制富集培养基,称量5g土样于富集培养液中,28℃摇床培养72h,重复2次,转接2次。
2.4.2 菌株的分离
配制培养基ⅠⅡⅢ。从第二次转接的富集培养液中吸取10ml摇匀的菌悬液于90ml无菌水,摇匀,从中吸取1ml菌液到9ml无菌水中,重复,一次可得到10-1,10-2,10-3,10-4,10-5菌悬液。吸取10-1,10-3,10-5菌悬液分别涂在分离培养基ⅠⅡⅢ。
2.4.3 菌株的纯化
从培养基Ⅲ中挑选长势良好的菌种于纯化培养基中纯化(配成菌悬液涂版)
2.4.4 菌株的保藏
将纯化的菌株保存在培养基Ⅵ中,冰箱中4℃环境下保存。
2.4.5 菌株降解特性试验
2.4.5.1 2, 4- D吸光值标准曲线绘制
配制2, 4- D浓度为0,10,20,30,40,50,60,100mg/l培养基Ⅶ(2, 4- D外其他成分为原液的1/10),确定合适波长为286nm,在此波长下石英杯紫外比色测定标准样品的吸光度,绘制标准曲线。
2.4.5.2 降解菌特性测定
a 培养基配制 配制培养基Ⅶ100ml于250ml三角瓶中,并灭菌。
b 接种 保存的菌株接种肉膏蛋白胨斜面活化,活化好的菌配成菌悬液按照5%的接种量接种于培养基Ⅶ。
c 培养 28℃摇床150rpmin培养。
每隔24小时分别测定降解菌的浊度和2, 4- D吸光值
d 菌浊度测定 每次从三角瓶中吸取4ml摇匀的培养液,定容至8ml,可见光分光光度计比色测定菌浊度。
e 离心 菌浊度测定后剩余定的培养液3800r/min离心15min
f 2,4—D浓度测定 吸取离心后培养液1ml定容至5ml紫外风光光度计比色测定2,4-D浓度。
降解率=(初始时浓度-结束时浓度)
初始时浓度⨯100
2.4.5.3 pH试验
配制培养基Ⅶ,用1mol/lNaOH与HCl调节其pH为4,5,6,7,8,9.按照上述方法接种培养每24小时测定菌浊度和2, 4- D浓度。
2.4.5.4 浓度梯度试验
在培养基Ⅶ中将2, 4- D配置成100,200,300,400,500mg/L浓度梯度,按照上述方法接种培养每24小时测定菌浊度和2,4-D浓度。
2.4.5.5 混菌试验
在培养基Ⅶ中将两种降解菌按1︰1比例接种,按照上述方法培养并每24小时测定菌浊度和2, 4- D浓度。
3 结果与分析
3.1 降解菌筛选
最终得到6株菌,革兰氏染色均为红色,具体菌落特征及照片见附录。
3.2 2, 4- D吸光度标准曲线
不同2, 4- D浓度梯度的标准液,紫外比色后得标准曲线如下图:
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
[1**********]0A浓度(mg/l)
120图3 2, 4- D标准曲线
A=0.0079C+0.0736(A为2, 4- D吸光度,线性回归得到拟合公式:C为2, 4- D浓度)。
R=0.99822,表明2, 4- D浓度与其吸光度有极显著线性关系。
表2 特性菌的降解率(%)
3.3 降解菌的降解率
3.4 降解菌特征曲线
由下图的菌株生长曲线可以表明,多数菌24h内通过对数期达到稳定期,但在48h左右浊度出现一些下降,可能是由于易效碳源已消耗,菌受到2, 4- D的抑制而出现下降,适应后浊度又上升。但C,G菌48h未出现浊度下降,可能是因为菌株对2, 4- D适应力强或以酵母膏为碳源时增长率低而掩盖2, 4- D抑制效应,以及24h间隔取样而掩盖2, 4- D抑制效应。
由降解率曲线可以看到,降解率在24h左右达到一峰值,主要原因是初期以酵母膏为主要碳源,菌生长迅速,细菌细胞壁对2,4-D产生吸附。随着酵母膏消耗,菌的生长受到碳源和2,4-D两方面的选择作用,降解率出现下降。当菌适应2,4-D后,降解率再次上升。72h以后,降解率快速下降,原因可能是由于随着2,4-D的降解,中间代谢产物积累,而这些中间代谢产物在286nm下也有较大吸光值。根据相关研究[28],2,4-D被首先转化为2,4-二氯酚,但只有部分或很少的没能进一步代谢2,4-二氯酚,共代谢产物因而积累。一些菌96h未观察到降解率下降,可能其下降其出现较晚。
综合观察图4图5,可发现降解率曲线与菌浊度曲线有同步变化的趋势,如多数菌48h左右,降解率与菌浊度都下降,表明菌浊度可在一定程度上反应降解率变化,2,4-D降解后作为碳源于能源供应菌的生长。但并不是所有菌均符合此规律,其他因素也会产生影响。
3.5 pH试验
选择菌株C进行pH试验,其降解率如图6:
从图中可以看出,随pH的变化,降解率也随之变化,呈现单峰曲线。pH值太高或太低均不利于菌株生长, 这是由于一方面pH值过高或过低均会引起微生物表面电荷的改变, 从而不利于细胞对营养物质的吸收;另一方面pH的改变会让有机化合物离子化,不利于有机化合物渗入细胞[29]。此菌最适pH为7-8之间,偏碱性,可能与2,4-D碱性条件下溶解度较大有关(2,4-D钠盐水中溶解度4.5%)。
由图7可看出极端pH环境对菌的生长产生抑制,如pH4时C菌的生长受到严重抑制,其OD600一直保持在低水平,培养过程中菌株无明显增加。综合图6图7,可得pH8时降解率最大的,其菌浓度也最大,证明降解率与菌生长有较好相关性。
3.6 浓度梯度试验
菌株E随2,4-D浓度变化曲线如图8。可以看出2,4-D浓度为100mg/l时降解率最高,72h时可达到80%左右。随着浓度的升高,降解率逐渐降低。500mg/l2,4-D作用下,降解率不到20%。
观察不同浓度降解菌生长随时间变化的曲线,如图9。首先可以看到菌浊度随2,4-D浓度变大而减小,其中2,4-D浓度在300mg/l以下时,其OD600较接近,72h时约在0.3-0.35之间,而400,500mg/l浓度OD600下较小,72h时约是400mg/l不到0.25,500mg/l不足0.2。证明2,4-D对菌的抑制作用随浓度变大而变强。同时这也符合降解率随浓度变化规律,表明菌浓度与降解率之间的相关性。随时间变化观察菌株生长量,100mg/l浓度下,自0h至72h OD600一直增长,表明此浓度下对菌生长无抑制作用或抑制作用不明显,而72h后的OD600下降,主要因为酵母膏与2,4-D以基本消耗,同时代谢产物的积累而产生的效应。当2,4-D为200和300mg/l时,对降解菌产生一定胁迫,故前24h OD600上升,而后OD600变化缓慢,为易效碳源酵母膏消耗后菌适应阶段,适应后OD600再次上升。400mg/l,500mg/l的2,4-D对降解菌则有明显抑制作用,所以当酵母膏消耗而使易效碳源减少,OD600出现一定下降,适应后OD600出现上升,但后期中间产物的积累使OD600下降。
3.7 混菌试验
选择A、E、H和I四株菌,两两之间等量混合接种,测得其特性如下:
由表较大提高的混菌组合。
可在下列图中观察混菌与其组成菌之间生长曲线的变化:
由以上6图可得,多数混菌的浊度比其组成单菌低,证明两菌在同一培养基中生长时,会产生拮抗竞争,而抑制各菌的生长。
4 结论
2,4-D作为一种广泛使用的农药,由于难以降解,在环境中累积而造成了对环境的破坏,引发一系列的问题,故而其降解研究成为热点。本试验利用2,4-D为唯一碳源,从受污染的图样中筛选2,4-D降解菌并对其特性进行研究。实验表明:
(1) 降解菌浊度变化与降解率变化有较好相关性,可作为考察菌株降解率的重要
参考。但并不绝对,一些情况下降解率的变化并不表现为相应菌浊度变化。一些其他因子也会产生重要作用,菌株代谢2,4-D可能用于克服不利环境,如高浓度,极端pH以及混菌之间的竞争,而不是用于菌种生长[30]。
(2) 2,4-D浓度对降解菌的生长及降解率有重要影响,高浓度将产生很强抑制效
应。
(3) pH会影响菌株表面电荷变化并引发有机物离子化从而影响降解率,试验所选
菌株最适pH在7-8之间,偏碱性。
(4) 混菌试验表明,2,4-D降解菌之间协同代谢较少,而拮抗竞争较多,可能与
2,4-D代谢中间产物2,4-二氯酚难以进一步降解有关。
(5) 易效碳源酵母膏的加入使讲解菌在前24h即通过对数生长,使后期能更大的
降解2,4-D。通过加入易效碳源来解除接种初期2,4-D抑制,缩短菌株适应期和对数生长期,从而获得更好的降解效率应是提高降解率的一个研究方向。
(6) 本试验是在三角瓶内液体摇床培养,内部环境较均匀。而在土壤介质中多大
程度表现本实验所得规律还需继续研究。
(7) 试验研究了同一环境因子不同水平下对降解菌生长和降解率的影响,但自然
环境很复杂,需要研究多因子的综合效应以更好的接近自然条件。
(8) 自然界存在的农药降解菌对环境安全有重要作用,但有时会降低农药效用,
破坏农药防治,因此,如何保证农药的防治效果,同时又能利用微生物减轻农药对环境的压力,是一个值得深入研究的课题[31]。
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附录一