质谱技术在中草药研究中的应用
1.敞开式离子化质谱技术的基本原理、特点和分类
AIMS集成了样品原位解吸附、待测物实时离子化和离子传输至质量分析器三个核心步骤。下面，以DART为例，介绍离子化的基本原理：利用He或者N2作为工作气通过放电室，放电室内部的阴极和阳极之间施加一个高达几千伏的电压导致高压辉光放电，使工作气电离成为含激发态气体原子或分子、离子、电子的等离子体气流。等离子体气流流经圆盘电极，选择性地移除某些离子后被加热，加热等离子体气流从DART口喷出至样品表面，完成热辅助的解吸附和离子化过程。离子化机理一般认为包括周围气体被激发态工作气体的彭宁（Penning）电离、进而发生的质子转移以及其他类型气相离子分子反应等过程。AIMS技术不仅可在常压下对待测样品离子化，而且离子源的敞开结构易于实现物体表面的直接离子化及质谱分析。这类离子源操作简便、快捷，无需复杂的样品前处理。AIMS技术的另一重要特征是快速及高通量，通常每个样品的分析时间不超过5s，充分展现了质谱快速分析的优势，为高通量分析提供了一种新的有效途径。因此，常压敞开式离子源开辟了质谱技术在无需样品前处理的直接、快速分析，表面与原位分析等领域的广阔应用领域。
AIMS离子源按照其离子化过程和机理可以分为三大类：
1）直接电离离子源。样品直接进入高电场被电离，如，在ESI源基础上发展起来的众多离子源，包括直接电喷雾探针（Direct electrospray probeionization，DEPI）、探针电喷雾电离（Probe electrospray ionization，PESI）、纸喷雾电离（Paper spray ionization，PSI）、场致液滴电离（Field induced dropletionization，FIDI）和超声波电离（Ultra-sound ionization，USI）等；
2）直接解吸电离离子源，同时起到对样品解吸和电离的作用。包括解吸电喷雾电离（Desorption electrosprayionization，DESI）、电场辅助解吸电喷雾电离（Electrode-assisteddesorption electrospray ionization，EADESI）、简易敞开式声波喷雾电离（Easy ambient sonic sprayionization，EASI）、解吸大气压化学电离（Desorption atmosphericpressure chemical ionization，DAPCI）、介质阻挡放电电离（Dielectric barrierdischarge ionization，DBDI）、等离子体辅助解吸电离（Plasma-assisted desorptionionization,PADI）、大气压辉光放电电离（Atmospheric glow dischargeionization,APGDI）、解吸电晕束电离（Desorption corona beam ionization,DCBI）、激光喷雾电离（Laser spray ionization,LSI）等；
3）解吸后电离离子源。这是一种两步机理离子源,第1步先对被分析物进行解吸附,第2步实现被分析物的电离过程,包括气相色谱-电喷雾质谱（Gas chromatographyelectrospray ionization,GC-ESI）、二次电喷雾电离（Secondary electrospray ionization,SESI）、熔融液滴电喷雾电离（Fused droplet electrosprayionization,FD-ESI）、萃取电喷雾电离（Extractive electrospray ionization,EESI）、液体表面彭宁电离质谱（Liquidsurface Penningionization,LPI）、大气压彭宁电离（Atmospheric pressure Penning ionization,APPeI）、电喷雾激光解吸电离（Electrospray laser desorptionionization,ELDI）、基质辅助激光解吸电喷雾电离（Matrix-assisted laser desorptionelectrospray ionization,MALDESI）、激光消融电喷雾电离（Laser ablation electrosprayionization,LAESI）、红外激光辅助解吸电喷雾电离（Infrared laser-assisted desorptionelectrospray ionization,IR-LADESI）、激光电喷雾电离（Laserelectrospray ionization,LESI）、激光解吸喷雾后离子化（Laser desorption spraypost-ionization,LDSPI）、激光诱导声波解吸电喷雾电离（Laser-induced acoustic desorptionelectrospray ionization,LIAD-ESI）、激光解吸-大气压化学电离（Laser desorption-atmospheric pressurechemical ionization,LD-APCI）、激光二极管热解吸电离（Laser diode thermal desorption,LDTD）、电喷雾辅助热解吸电离（Electrospray-assisted pyrolysisionization,ESA-Py）、大气压热解吸-电喷雾电离（Atmosphericpressure thermal desorption-electrospray ionization,AP-TD/ESI）、基于热解吸敞开式电离（Thermal desorption-based ambient ionization,TDAI）、大气压固态分析探针（Atmosphericpressuresolids analysis probe,ASAP）、实时直接分析（Direct analysis in real time,DART）、解吸大气压光致电离（Desorption atmospheric pressurephotoionization,DAPPI）等。
建立一种新的方法，能够对中草药中的药效成分和杂质进行分析，这对于中草药的质量评价和质量控制有重要意义。敞开式离子化质谱技术的发展为中草药分析提供了一种快速、直接的手段。本文综述了不同类型敞开式离子化质谱在中草药分析中的应用，并对典型分析案例加以讨论，总结的应用详情列于表1。
表1.敞开式离子化质谱在中草药研究中的应用
敞开式离子化质谱技术
中草药
分析物
文献
直接电离
DI
黄连
小檗碱、黄连碱、巴马汀
10
何首乌
2,3,5,4’-四羟基芪-2-O-葡萄糖甙-3”-O-没食子酸酯
10
南、北五味子
五味子醇甲、五味子醇乙
10
Tissue spray
西洋参
人参皂苷、氨基酸、二糖
11
Leaf spray
生姜
姜辣素
12
银杏籽
银杏毒素
12
圣罗勒
乌索酸、齐墩果酸及其氧化产物
13
甜叶菊叶
甜菊糖苷类
14
Direct plant spray
八角茴香
莽草毒素
15
Field-induced DI
长春花
长春碱、脱水长春碱
16
iEESI
银杏叶
银杏毒素、精氨酸、脯氨酸、蔗糖
17
Wooden-tip
贝母
贝母素、精氨酸、蔗糖
18
Field-induced wooden-tip
黄连
小檗碱、黄连碱、巴马汀、苹果酸、柠檬酸
19
甘草
甘草酸、甘草素
19
黄芩
黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷
19
苦参
苦参素、苦参碱、苦参酮
19
Al-foil ESI
西洋参
人参皂苷
20
附子
苯甲酰乌头原碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱
20
Pipette-tip ESI
黄连
小檗碱、黄连碱、巴马汀
21
牛蒡子
牛蒡苷及其苷元、二糖
21
莲子心
莲心碱、甲基莲心碱
21
人参
人参皂苷
21
西洋参
人参皂苷
21
三七
人参皂苷
21
北五味子
五味子甲素、乙素、五味子酯甲、酯乙
21
直接解吸电离
DESI
颠茄
莨菪碱、东莨菪碱
22
毒参
毒芹碱类
22
曼陀罗
16种托品烷类生物碱
22
阿托品
23
甜叶菊
甜菊糖苷类
24
鼠尾草
克罗烷型二萜类
25
青脆枝
喜树碱类
26
吴茱萸
吴茱萸碱、吴茱萸次碱
27
贯叶连翘
金丝桃苷类、糖类
23
金丝桃苷类、长链脂肪酸类
28
大麦
羟氰苷类
29
白毛茛
小檗碱类
30
枳壳
橙皮甙、柚皮甙、苦橙甙等黄酮类
31
DAPCI
南、北五味子
萜品烯类
32
人参、红参
人参皂苷
33
DCBI
黄连
黄连素、黄连碱
34
黄藤
黄藤素
34
鱼腥草
别隐品碱、白屈菜红碱、原阿片碱、血根碱
34
黄柏
药根碱
34
粉防己
轮环藤酚碱
34
两面针
两面针碱、白屈菜赤碱
34
解吸后电离
DART
颠茄果
阿托品、莨菪碱
35
蒌叶
蒌叶酚
36
芫荽
大麻素类
37
绿薄荷
大麻素类
37
罗勒
大麻素类
37
乌头属药材
乌头碱类生物碱
38
曼陀罗籽
托品碱、莨菪碱
39
萝芙木
单萜吲哚类生物碱
40
姜黄
姜黄素类
41
荜澄茄果
荜澄茄油烯
42
极细当归
藁苯内酯
43
朝鲜当归
日本前胡素、日本前胡醇
43,44,51
白芷
白当归脑
43
川芎
川芎内酯
43
槟榔子
槟榔碱、槟榔次碱
45
延胡索
延胡索碱
45
贝母
贝母素、去氢贝母碱
45
钩藤
钩藤碱
45
黄芩
黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷
45
人参
人参皂苷类
45
丁公藤
东莨菪内酯
46
制川乌
单酯和双酯型二萜类乌头碱
47
八角茴香
莽草毒素
48
桑叶
脱氧野尻霉素
49
厚叶岩白菜
熊果素、岩白菜素、鞣花酸、没食子酸
50
吴茱萸
吴茱萸碱、吴茱萸次碱
51
北五味子
五味子素、戈米辛
51,52
Nano-EESI
人参
人参皂苷
53
LAESI
孔雀草
花青素、山奈酚等黄酮类
54
鼠尾草
萜类
55
DAPPI
鼠尾草叶
鼠尾草酸及其衍生物
56
LAAPPI
鼠尾草
萜类
55
枳壳
川皮苷、黄酮醇类、沉香醇
57
PALDI
黄芩
黄芩素、汉黄芩素
58
2.1直接电离离子源
直接电离离子源是基于电喷雾原理的直接电离敞开式离子化质谱技术,将样品组织中分析物直接电离进行质谱分析。这项技术快速、直接、实时、原位,无需样品前处理,适用于中药材直接分析。主要应用技术包括：直接电离（Direct ionization）、组织喷雾电离（Tissue spray）、叶片喷雾（Leafspray）、直接植物喷雾（Direct plant spray）场致直接电离（Field-induced DI）、内部萃取电喷雾电离（Internal extractive electrospray ionizationmass spectrometry，iEESI）等。虽然这些技术的名称不同,但它们的原理和分析策略是相似的,即,将样品本身作为固体基质,应用溶剂和高电压使分析物溶解或萃取到溶剂中,液相分析物分子在高电场作用下直接电离、喷雾、产生带电液滴和离子进行质谱分析。
姚钟平课题组在固体基质下的电喷雾离子化机理与应用方面做了大量的研究工作。固体基质电喷雾电离是将中草药的粉末、混悬液、提取液附着于固体基质上用于直接电离分析,可用的固体基质包括：纯金属探针、纸三角、木片、铝箔、移液器头等。因铝箔具有惰性、不渗透性、相对刚性等特点,可以折叠承载溶剂,对粉末样品有目的性的提取,在敞开式的环境下进行电喷雾质谱分析。铝箔电喷雾质谱已经成功应用于西洋参和附子等中药粉末样品中主要成分的测定。移液器头模式的分析是将移液器头与质谱进样器和进样泵连接,在线提取进样器头中的中药粉末,加以高电压使带电有机溶剂通过中药粉末将分析物提取出来后电离,经由质谱分析。这种移液器头模式的分析已成功应用于人参、西洋参和三七中皂苷类成分、南、北五味子中木脂素类成分和多种药材中生物碱类成分的测定。
2.2直接解吸电离离子源
自DESI问世以来，其在中草药分析中的应用已被陆续报道。采用的主要方式包括：分析物的表面解吸电离、反应直接解吸电离、分析物的表面成像、薄层色谱与直接解吸电离质谱联用等，其中应用最广泛的是分析物的表面解吸电离，无需中药材样品的前处理，可直接分析。
DAPCI是应用大气压电晕放电从化学试剂中产生电子、质子、亚稳态原子、水合氢离子和质子化溶剂离子，去解吸电离样品表面的分析物，进行质谱分析，主要用于分析低分子质量的挥发性或半挥发性化合物。已报道的研究有南、北五味子中萜品烯类成分和人参、红参中皂苷类成分的分析。
DCBI是将高直流电压加在尖针上引发氦原子电晕放电，在电晕针附近产生激发态离子，与分析物在样品表面发生反应，产生单电荷分析物离子，进行质谱分析。应用DCBI分析中草药中低极性成分是极具挑战性的。为了解决这一难点，文献报道了一种设计方案，将反应试剂（饱和氢氧化钠与甲醇溶液，3:7，V/V）加入样品中以提高DCBI的电离效率，并将该方法成功应用于6种中药材中生物碱的测定，并将其与TLC联用测定生物碱的含量。
2.3解吸后电离离子源
DART-MS是在中草药分析中应用较为广泛的一种敞开式离子化质谱技术，其离子源目前已有商品化的产品。DART-MS的主要分析策略包括：分析物的表面解吸电离，将样品置于DART源与质谱进口；粉末样品的分析，将填充样品的玻璃毛细管（棒）置于DART源加热的气体束中电离；液态样品分析，将样品滴在熔点管（浸管）、金属筛网（不锈钢金属网格）上面，置于DART源与质谱进口之间；TLC与DART-MS联用分析，是将化合物在薄层板上分离后，将薄层板置于DART源与质谱进口之间，分析物经加热气体的热解吸附，通过离子-分子反应使分析物电离再引入质谱进行分析。
EESI和nano-EESI是基于电喷雾电离的敞开式离子化质谱技术，发明最初主要被应用于液态和气态样品分析，被分析物从溶液相或气相样品中被萃取出来，经由电喷雾电离产生离子进行质谱分析。陈焕文课题组将Nano-EESI-MS技术成功应用于人参中人参皂苷的测定。将激光解吸或消融与电喷雾结合的敞开式离子化技术（LAESI）适用于固体样品分析，在中草药分析中的应用主要有：孔雀草根、茎、叶中的成分分析和鼠尾草叶中萜类成分的测定。将敞开式离子化技术与光致电离原理相结合，应用于中草药研究中，主要有两种方式：解吸大气压化学电离（DAPPI）和激光消融大气压光致电离（LAAPPI）。这两种方式可以使样品表面非极性和中性分析物有效电离进行质谱分析，另外，这两种方式还具有表面成像功能，例如，DAPPI-MS和LAAPPI-MS技术在鼠尾草叶成分表面成像研究中的应用，以及枳壳叶中主要药效成分的DAPPI-MS分析等。等离子体辅助激光解吸质谱（PALDI-MS）已被成功用来研究黄芩中黄芩素和汉黄芩素成像，结果显示，此成分集中分布于根的表皮维管束边缘。
2.4在中草药质量评价和质量控制中的应用
随着敞开式离子化质谱技术的不断发展，其在中草药质量快速评价和控制中的应用日益广泛。敞开式离子化质谱指纹分析方法能够给出中草药成分的整体化学轮廓，可用于评价中草药质量的稳定性、追溯基源、鉴别真伪。应用敞开式离子化质谱方法评价和控制中草药质量，首先要选择一种适合的敞开式离子化技术，建立指纹图谱分析方法，进而对样品进行分析，将获得的数据采用多变量统计分析方法处理，例如，主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、聚类分析（HCA）等。
目前，应用DART-MS技术结合多种统计分析方法，成功区分了蒌叶的不同栽培品种；区分了曼陀罗、萝芙木、荜澄茄以及伞形科中药的不同品种，并鉴定了其中标志性化学成分；区分了不同来源的当归；鉴定了川乌中标志性化学成分，并区分了其炮制程度的不同。将DAPCI-MS技术结合PCA分析应用于南、北五味子研究，成功区分了不同栽培品种和野生品种，并区分了不同炮制品种。应用Wooden-tip ESI-MS结合PCA和PLS-DA技术，鉴定了川贝母粉末的品种，并区分了其中掺伪品。
2.5本实验室的研究工作
中药成分的确认和定量分析是近年来AIMS的重要发展方向之一，本实验室选用商品化的DART为离子源，开发的方法具有较强的可重复性和实际应用价值。研究内容主要包括5个方面。
1）中药的快速分析：研究了8种中药的化学成分，实现了生物碱类、黄酮类和部分人参皂苷的快速、直接分析；并对DART的电离机制进行了较深入的讨论；
2）中药成分的DART定量分析：针对中药延胡索的功效成分延胡索甲素和乙素进行DART定量分析，利用甲基化衍生和氘代内标实现了人参皂苷的DART定量分析；
3）对DART技术不易电离成分的分析：本实验室首次采用瞬时衍生化试剂四甲基氢氧化铵对皂苷和寡糖类成分进行DART源内的瞬时甲基化，通过甲基化衍生增加皂苷成分的挥发性，生成铵加合物离子，实现了多羟基化合物（如人参皂苷和寡糖）的DART分析检测。其中，四甲基氢氧化铵不仅发挥了衍生化的作用，同时还作为辅助电离试剂增强了皂苷成分在DART中的灵敏度。因为该反应属于自由基反应，反应控制难度较大，重复性还有待提高；
4）DART用于农药残留的检测：针对100余种农残成分开展了DART快速检测研究，发现多种农药成分在DART电离过程中不仅有加合离子（离子-分子反应产物），还产生碎片（过剩能量产生），此外，实验发现有机磷农药会发生氧硫交换的氧化反应，并对其反应机制进行了深入探讨；
5）开展DART电离机理研究：研究发现，不同的工作气体（氦气、氩气、氮气等）因其不同的电离能和氮气的振动自由度影响，使得其在电离过程中展现出不同的特性，虽然氦气因具有更高的电离能应用范围更广，但是在某些场合下使用电离能较低的氩气和氮气（较氦气价格低廉）产生的待测化合物碎片较少，再适当引入辅助（make up）试剂可有效地提高待测物的灵敏度。经过研究发现，具有较低电离能的氟苯和丙酮等作为辅助试剂能明显的提高待测物的分析灵敏度。
中药品质的安全有效主要取决于其中所含的药效成分和杂质，这就要求应用快速、可靠的分析方法来评价和控制中药材的质量。目前，多种敞开式离子化质谱技术已成功应用于多种中药中多种类型化学成分的检测，并可对多种中药的品质进行综合评价和质量控制。一般来讲，对于挥发性较好或质子亲合能较高的成分，如生物碱，黄酮类等成分，电离可以直接发生在植物组织表面附近而不需借助溶剂和其他基质。为了得到好的分析结果，对于皂苷类等组分需溶剂辅助，对于糖类组分的分析甚至需要简单的衍生化。敞开离子化源，其原理之一是被分析物周围的气相离子—分子反应，这些反应很难达到经典的密闭CI源平衡条件，因此，在实验条件控制，数据的重复性方面还存在一些困难，尚需技术本身不断完善。另外，对分析物的准确定量方法也有待开发及改进。以上这些问题需要分析化学家和质谱学家的持续关注和潜心研究，相信在不远的将来，敞开式离子化技术与小型质谱仪器结合的分析方法能应用于中药生产的田间地头、成品药生产线、中医诊断的辅助等更多的中医药领域，为推动传统中医药的现代发展发挥更大的作用。
附：“质谱技术在中草药研究中的应用”专辑目次
（文章来源：2017年《质谱学报》第1期 作者：黄鑫，刘文龙，张勇，刘淑莹）