乙醇脱氢酶检测试剂盒(乙醛微板法)
乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)
简介:
乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase ,ADH) 的系统名为乙醇:辅酶I 氧化还原酶(alcohol :NAD+ oxidoreductase),大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中,是一种含锌金属酶,具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶,催化伯醇和醛之间的可逆反应: CH3CH2OH+ NAD+→ CH3CHO +NADH+ H+。在人和哺乳动物体内,乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系,参乙醇脱氢酶与体内乙醇代谢,是人和动物体内重要的代谢酶。作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶,它在很多生理过程中起着重要作用。丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醇脱氢酶(ADH)是乙醇发酵途径的关键酶,无氧呼吸途径代谢产物的过程积累对细胞产生毒性,影响线粒体结构和三羧酸循环的相关酶活性。
Leagene 乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法) 检测原理是在弱碱条件下,以乙醛为底物,乙醛在ADH 催化下被NADH 还原为乙醇,ADH 每催化1分子乙醛消耗1分子NADH ,通过分光光度比色法(酶标仪) 测定吸光度的变化,计算出NADH 的消耗速率进一步推算出乙醇脱氢酶活性水平。该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中乙醇脱氢酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。
组成:
自备材料:
1、 研钵或匀浆器 2、 离心管或试管 3、 低温离心机 4、 96孔板 5、 酶标仪
操作步骤(仅供参考) :
1、 配制ADH Lysis buffer工作液:取出ADH Lysis buffer和PMSF ,恢复至室温,ADH
Lysis buffer :PMSF 按一定比例混合,混匀,即配即用,不易久置,否则蛋白酶抑制剂PMSF 的效率会有所下降。 2、 准备样品:
①植物样品:取植物组织(根系) 清洗干净,切碎,植物组织:ADH Lysis buffer工作液按一定的比例,加入预冷的 ADH Lysis buffer工作液,冰浴情况下充分匀浆或研磨。离心留取上清液即为乙醇脱氢酶粗提液。短期4℃保存待用,长期-20℃冻存待用。
②血浆、血清和尿液样品:血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,冻存,用于乙醇脱氢酶的检测。
③细胞或组织样品:取恰当细胞或组织裂解液,如有必要用ADH Lysis buffer工作液进行适当匀浆,离心,取上清液,冻存,用于乙醇脱氢酶的检测。
④高活性样品:如果样品中含有较高活性的乙醇脱氢酶,可以使用ADH Lysis buffer工作液进行恰当的稀释。
3、 配制NADH 工作液:取出NADH ,恢复至室温,准确溶解于ddH 2O ,混匀,预冷备
用。-20℃保存1周有效。注意:该NADH 工作液为过量。
4、 配制ADH Assay buffer工作液:取出ADH Assay buffer、NADH 工作液,恢复至室
温,ADH Assay buffer :NADH 工作液按一定的比例混合,混匀,即为ADH Assay buffer 工作液。最好即配即用,4℃预冷备用,-20℃保存1周有效。
5、 ADH 加样:按照下表设置对照孔(备选,一般可以不设对照孔) 、测定孔,溶液应按照
顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的乙醇脱氢酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测最好能设置平行孔。
6、 ADH 测定:加入ADH 启动剂,立即以酶标仪测定吸光度(记为A 0) 并同时计时,每隔
30s 测定一次吸光度,其中至1min 时吸光度记为A 1,记录其变化。Leagene 建议加入ADH 启动剂后立即检测,加样时间越短越好,其反应基本在1-3min 内,其后反应趋于平缓。
注意:该反应系统是利用速率变化,求得相应OD 的变化,进而推算出NADH 的消耗速率,再进一步推算出乙醇脱氢酶的量。因此加入ADH 启动剂立即计时很重要,每次检测指标不宜过多,否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。
计算:
乙醇脱氢酶活性定义:每分钟NADH 氧化吸光度变化0.01为1个酶活力单位。 液体样品ADH(U/ml·min)=ΔA /(0.01×t ×0.005)
式中:ΔA =A 0−A 1(如有必要,可再减去对照最初1min 的吸光度变化量) 0.01=每分钟NADH 氧化吸光度变化0.01为1个酶活力单位 t=1=检测时间(min) 0.005=待测样品体积(ml)
组织样品ADH(U/g·min)=ΔA /(0.01×t ×W)
式中:ΔA =A 0−A 1(如有必要,可再减去对照最初1min 的吸光度变化量) 0.01=每分钟NADH 氧化吸光度变化0.01为1个酶活力单位 t=1=检测时间(min) W=待测样品鲜重或干重(g)
组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100%
注意事项:
1、 实验材料应尽量新鲜,如取材后不立即使用,应存于-20~-80℃。 2、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂,同时需避免反复冻融。
3、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑分光光度计的最小检
测体积。
4、 该反应系统是利用速率变化,求得相应OD 的变化,进而推算出NADH 的消耗速率,
再进一步推算出乙醇脱氢酶的量。因此加入ADH 启动剂立即计时很重要,每次检测指标不宜过多,否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。
5、 酶液的稀释度应尽量控制在A340/min下降范围在0.1-0.2之间,以便减少实验误差。 6、 ΔA 为反应最初1min 内吸光度变化的绝对量,如有必要可减去对照液最初1min 的吸
光度变化量。
7、 所测样本的浓度过高,应用ADH Lysis buffer工作液稀释样品后重新测定。
有效期:6个月有效。