无菌原料药生产的无菌工艺验证

无菌原料药生产的无菌工艺验证

[关键词]：无菌原料药, 无菌工艺验证, 模拟介质, 培养基, 工艺过程模拟

健康网讯：

无菌原料药的生产通常是把精制过程和无菌过程结合在一起，将无菌过程作为生产工艺的一个单元操作来完成。也称之为无菌工艺。将非无菌的原材料转化为无菌的原料药的方法很多，目前生产上最常用的是无菌过滤法，即将非无菌中间体或原材料配制成溶液，再经0.2μm 孔径的过滤器过滤除菌，在以后一系列精制单元操作中一直保持无菌，最后生产出符合无菌要求的原料药。

典型的无菌原料药精制工艺为：将原材料配制成溶液→过滤除菌→结晶→过滤→洗涤→干燥→粉碎→混合→分装。灭菌过程包括除菌过滤、设备灭菌、包装材料灭菌、衣物灭菌等。这些灭菌过程经过验证方能保证从非无菌状态转化成无菌状态。无菌工艺只有经过验证才能确保产品的无菌性能。验证过程一般是选择合适的介质模拟生产流程，使介质通过整个生产系统，然后取模拟介质培养，观察是否有细菌生长。

1 验证前的准备

无菌工艺验证是生产、质量、工程和其它部门之间广泛合作的一项工作。验证前需做以下准备工作。 1.1 生产设施的设计和确认

生产设施的设计应能使潜在的污染降低到最小，应易于清洁和消毒；产品或物料敞开处的空气要有一定的品质要求；温度和湿度的控制要适宜，应能防止污染和交叉污染。应重视设计上的细节，减少污染源，确保无菌生产。

1.2 公用工程和环境的确认

影响产品质量的公用工程如蒸汽、压缩空气、加热、制冷、水系统等都应经过确认，其中任一系统出现故障，都有可能导致产品发生污染。应制订公用工程的维护计划并按计划执行。

1.3 设备和工艺的确认

所有的设备、无菌环境、计算机控制系统以及生产工艺都应经过验证。产品暴露是发生污染并导致无菌工艺验证失败的主要原因之一。为防止或降低污染发生的几率，对暴露产品提供百级空气层流罩非常重要；已灭菌的产品在由灭菌器到生产线过程的保护也至关重要，应尽量避免人员对设备或物料的接触性操作。

1.4 设备的清洗和灭菌规程的确认

接触模拟介质的设备表面应清洗灭菌，并防止灭菌后的再污染。对生产抗菌性或杀菌性的药品，这种清洗尤为重要。否则会使模拟介质染菌而使验证失败。清洗和灭菌过程应经过验证，保证清洗彻底和灭菌成功。

1.5 模拟介质的选择和灭菌

选择的模拟介质应有如下特征：①没有抑菌作用，最好具促进细菌生长的作用。如果选择对细菌生长有促进作用的固体培养介质做验证，对生产环境的保护则特别重要。因为有些操作是使介质暴露，介质的尘粒会飘散在某些较难清洗的地方，如空调系统的送风口和回风口附近，给细菌的滋生创造了条件，所以应有保护措施，尽量使难清洗的死角不被介质污染。②模拟介质应在培养基内有较好的溶解度。如溶解性不好，培养基会发生混浊，影响结果的判断。③模拟介质加入培养基后，不应影响培养基质量和pH 的变化，以适应大多数细菌的生长。④对设备无腐蚀性，对人体无害，对环境无污染。

通常可选用的模拟介质有PEG 4000、PEG 6000、乳糖和甘露醇等。模拟介质在使用之前应灭菌。方法有γ-射线灭菌、湿热灭菌等。在确定灭菌参数后，都应对该灭菌方法进行

验证。

1.6 培养基的选择和灭菌

一般应针对不同的微生物选择不同的培养基。如需氧菌和厌氧菌适宜用巯乙醇酸盐培养基，需氧菌和真菌适宜用大豆酪蛋白消化物培养基。由于无菌工艺验证前，不知道系统中存在什么样的微生物，而选择多种培养基分别测试又较难做到，因此应根据实际的生产工艺和环境，选择适宜大多数微生物生长的培养基。相比之下，推荐用大豆酪蛋白消化物培养基，因为多数无菌原料药的生产都和空气接触，污染厌氧菌的几率很小，被污染的微生物大多数为需氧菌或真菌。

培养基灭菌的方法，有γ-射线灭菌法和湿热灭菌法，并对选用的灭菌方法进行验证。培养基灭菌后应做生长促进试验。根据标准操作规程（SOP) 制备大豆酪蛋白消化物培养基并灭菌，分装于预定数量的试管中（此数量应有统计学意义）。一半试管中接种枯草芽抱杆菌，接种量＜100CFU （colony forming unit，菌落形成单元）；另一半试管中接种白色念珠菌，接种量＜100CFU 。接种后盖塞、封口，分别在（32.5±2.5）0C 和（22.5±2.5）℃培养7d, 其间应至少有50％以上接种试管培养基中出现明显的所接种微生物生长。

2 验证的实施

2.1 工艺条件的选择

无菌验证的工艺条件要模拟生产实际，并充分考虑可能遇到的条件，以下列举工艺过程中部分工艺条件的选择。

物料暴露操作：无菌原料药的生产工艺具有设备种类多而复杂、管路长的特点，且不同生产工艺的特点也不尽相同，应根据各自的特点选择固体或液体模拟介质。即使尽量减少设备内部和物料产品的暴露，但仍不可避免有些开口处，则应有呼吸器或百级空气层流保护。验证时应有模拟这些物料暴露的操作。

结晶操作：有些生产工艺有结晶的操作，因结晶过程有相变产生，是否会影响微生物的生长是一个应考虑的问题，也使模拟过程存在困难。最好的办法是选择2种模拟介质，它们在结晶过程发生反应生成另一种模拟介质，但这样的选择可能会有很大困难。也可用同一种液体模拟介质模拟结晶过程流经所有管路加到结晶罐中。若结晶过程有加晶种的操作，模拟过程中也应有这样的操作，晶种也可用模拟介质代替。为使晶体粒度均匀，有些结晶过程需要降温，在模拟过程中则不应降温，因微生物在低温下不易生长。

干燥和分装操作：干燥过程中的温度一般会抑制微生物生长，甚至会杀灭微生物，在模拟过程中应保持室温，以免验证失败。也有用冷冻干燥除湿的情况，但模拟冻干参数的选择也不应抑制细菌的生长。总之，为促进细菌生长，允许工艺参数和实际情况不一致，但差别不能太大。无菌原料药的分装量一般较大，在分装过程中应减慢分装速度，以增加产品暴露的机会，在最差状况下进行操作。

2.2 操作时限

原料药生产中的每一操作都应有操作时限来保证己灭菌的物品免受微生物的污染或产品变质。操作时限越长，产品受污染的几率越大。在无菌工艺验证时，应将操作时限调整至最大，在最差状况下操作。尤其是己灭菌物品由灭菌到使用时的保存时间更重要，在验证时，应将已灭菌物品至少放置到规定的保存时间。

2.3 环境监测

在验证过程中环境的质量至关重要，应在恶劣的环境下进行操作，但又不能使产品染菌。一般采用增加操作人员数量的办法劣化环境。应对环境进行监测以评价验证过程，所有暴露产品的操作都应监测本区域的环境，包括无菌室的温度、湿度、换气次数、尘埃粒子、沉降菌、浮游菌、人员和表面微生物。

沉降菌和浮游菌用培养皿进行测试，培养基为营养琼脂。培养皿应放置在微生物情况最差的部位。验证过程中，在分装区域放置2个以上的取样培养皿连续暴露取样，并增加取样

的频率，暴露时间应为分装的全过程，但不宜超过4h, 以免营养琼脂变干而影响细菌的生长。营养琼脂在使用前应做微生物生长促进试验，方法同培养基的生长促进试验。测试浮游菌可用缝隙一琼脂撞击采样法、离心采样法、液体撞击采样法及膜过滤法。一般来说，浮游菌比沉降菌更能反映环境的质量。

表面微生物的测试可用擦拭法或Rodac 碟。用擦拭法测定前应先测回收率，影响回收率的因素有微生物的种类和数量，不同的操作人员进行测试会得到不同的回收率。用Rodac 碟测试，方法较方便，但会有营养物质残留在被测试的表面，应清洗干净。

尘埃粒子测试可以采用不同类型的粒子计数器，目前国际上采用Royco 、Climat 、Coulter 等。尘埃粒子监测的结果应能证明产品暴露的关键区域空气质量达到了100级洁净区的空气质量标准。我国有指导环境监测的国家标准，国际上流行的标准是FS209E, 它对环境监测及结果评价给出了很详细的指导。

2.4 工艺过程的模拟

由于一般原料药生产工艺都经过结晶过程，其间会有相变。因此，无菌工艺验证不能完全按照原来的实际工艺来进行模拟。可分步完成：①从原材料配制起，以纯化水代替原材料，经除菌过滤、结晶、过滤、洗涤后，从过滤器底部将水放掉。②过滤器蒸汽灭菌，然后加入己灭菌的模拟介质，按生产工艺进行干燥、粉碎、混合、分装。

生产过程中可能有升温、降温过程，此时应注意模拟介质对温度的敏感性。

2.5 工艺各步骤中的取样

生产工艺中每个步骤如结晶、过滤、干燥等都应取样进行无菌测试，取样频率和数量应有代表性，并具有统计学意义。样品取出后不应被污染，最好立即测试。

2.6 样品培养

阴性对照：验证过程中，随机取出一定数量的、有代表性的装有培养基的包装容器，作

为阴性对照。

阳性对照：验证过程中，随机取出一定数量的、有代表性的装有模拟介质的包装容器，一半接种浓度＜100个微生物/0.1ml枯草芽抱杆菌，另一半接种浓度＜100个微生物/0.1ml自色念珠菌。接种后分别在适宜的温度下培养7d, 其间应至少有50％的接种包装容器中有明显的所接种微生物的生长，以此作为阳性对照。

样品培养：将分装的产品在操作现场灌装培养基，然后密封，检查密封性。全部产品应在适宜的温度下培养14d, 然后检查全部样品的微生物生长情况。若发现染菌应注明批号和包装容器号，同时检查密封情况。若有破损注明原因。污染的样品应做微生物鉴别，至少鉴别到种别。

2.7 结果评价标准

在制剂中以污染水平＜0.1％为接受标准，但在无菌原料药生产中，包装单位较大，得到的总分装容器数一般较小，使抽样测试和结果计算失去统计学意义。且生产批量是固定的，因此所有产品都应培养。若发现一个容器染菌，就认为整个无菌生产工艺中有染菌，应立即停产，调查产生污染的原因，采取措施后重复做验证，至少连续3批全部合格才可认为此无菌生产工艺符合无菌要求。

3 验证报告

验证完成之后应撰写验证报告，内容包括以下：验证题目、验证目的、参加验证部门和人员、采用的工艺参数和操作时限、选择的模拟介质和培养基、培养条件、验证最终结果和分析、对期望结果偏差的说明。验证报告应由企业质量保证部主管批准。只有当最终结果合格并且验证报告经过批准后，企业的无菌原料药生产才能开始（或继续）进行。 4 再验证

再验证的目的是保证无菌生产工艺没有随生产的运行产生污染。应有SOP 对再验证的频

率做规定。一般新生产线在投产之前要做无菌工艺验证，验证通过后该生产线才能投入使用。正在运行的生产线应每年至少进行2次无菌工艺验证，每个操作人员每年至少参加一次无菌工艺验证，直接接触药品的生产岗位操作人员若有变动，应对产品的无菌工艺进行再验证。 （中国医药工业杂志第35卷第12期）