DNA凝胶电泳常用试剂配制

DNA的凝胶电泳

1.琼脂糖凝胶电泳

含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围

凝胶中的琼脂糖含量〔％（w/v）〕

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

常用电泳缓冲液

缓冲液

使用液

1×:0.04mol/L Tris－乙酸

Tris-乙酸（TAE）

0.001mol/L EDTA

100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

10×:108g Tris碱

1×:0.09mol/L Tris-磷酸

Tris-磷酸（TPE）

0.002mol/L EDTA

40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

5×:54g Tris碱

Tris-硼酸（TBE）

0.001mol/L EDTA

20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

碱性缓冲液

1mmol/L EDTA

2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

a．TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5

×溶液，出现沉淀后则予以废弃。

以往都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮存液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。

进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的1×TBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流通量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

b. 碱性电泳缓冲液应现用现配。

b

a

线状DNA分子的有效分离范围（kb）

5－60 1－20 0.8－10 0.5－7 0.4－6 0.2－3 0.1－2

浓储存液（每升） 50×:242g Tris碱 57.1ml冰乙酸

15.5ml 85％磷酸（1.679g/ml）

0.5×:0.045 mol/L Tris-硼酸

27.5g硼酸

1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH

凝胶加样缓冲液

缓冲液类型

Ⅰ

6×缓冲液 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 40%(w/v)蔗糖水溶液

0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液

0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 30％甘油水溶液

0.25％溴酚蓝 40%(w/v)蔗糖水溶液

碱性加样缓冲液 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA

18%聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液

0.15%溴甲酚绿 0.25％二甲苯青FF

贮存温度 4℃

Ⅱ 室温

Ⅲ 4℃

Ⅳ 4℃

Ⅴ 4℃

使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品浓度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5－1.4％的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围

丙烯酰胺〔％（w/v）〕

有效分离范围（bp） a

3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0

1000－2000 80－500 60－400 40－200 25－150 6－100

二甲苯青FFb

460 260 160 70 60 45

溴酚蓝b 100 65 45 20 15 12

a. N,N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的1/3.

b. 给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片断的粗略大小（核苷酸对） 30％丙烯酰胺：

丙烯酰胺 29g

N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 1g 加水至100ml

将溶液加热至37℃使化学药品溶解

小心：丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收。丙烯酰胺的作用具有累积性。称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍应小心处理。 10％过硫酸铵 过硫酸铵 1g 加水至10ml

可在4℃保存数周。

制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积（总体积100ml）

试剂 30％丙烯酰胺

水 5×TBE 10%过硫酸铵

制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的毫升数

3.5％ 11.6 67.7 20.0 0.7

5.0％ 16.6 62.7 20.0 0.7

8.0％ 26.6 52.7 20.0 0.7

12.0％ 40.0 39.3 20.0 0.7

20.0％ 66.6 12.7 20.0 0.7

每100ml丙烯酰胺凝胶溶液加35ulTEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺），旋动容器混匀。

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聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤及试剂配方

聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP

（Single Strand Conformation Polymorphism，单链构象多态性）。

原理：在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不

同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。

SSCP与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：

a． SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺 80g，N- N，-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）

b． 工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。

c． 由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N- N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。

1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g

N- N，-亚甲双丙烯酰胺 1g 加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月 1.2 配制5×TBE缓冲液：

TRIS碱 54克 硼酸 27.5克 EDTA 3.72克 加水至1L 1.3 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积

1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤

2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶 2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净 2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干 2.4 用乙醇擦洗玻璃板

2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀） 2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平

2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位

2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形）

2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽

2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。

2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。

2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。

2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染

3. 电泳后的银染检测

3.1 原理：

影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。 3.2 银染

银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水

银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。 将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。 3.3 显影

显影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml

显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。 将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。

一、电泳试剂：

1、30％聚丙烯酰胺(29:1)

丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺

过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE

Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂

1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)：

30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染：

1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。

3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。

5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。

电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。

在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深

我国的试剂规格基本上按纯度（杂质含量的多少）划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯等7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3种。

（1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。

（2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。

（3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。

（4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。

除了上述四个级别外，目前市场上尚有：

基准试剂（PT：Primary Reagent）：专门作为基准物用，可直接配制标准溶液。

光谱纯试剂（SP：Spectrum pure）：表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分达不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。

纯度远高于优级纯的试剂叫做高纯试剂（≥ 99.99%）。

目前，国外试剂厂生产的化学试剂的规格趋向于按用途划分，常见的如下：

生化试剂 （BC：Biochemical）

生物试剂 （BR：Biological reagent）

生物染色剂 （BS：Biological Stain）

络合滴定用 （FCM：For Complexometry）

层析用0S-J1[ j;B2~（F1v7G分析化学,论坛,化学分析,仪器分析,分析测试,色谱,电泳,光谱 （FCP：For chromatography purpose）

荧光分析（FIA）

微生物用（FMB）

显微镜用 （FMP：For microscopic purpose） 合成用-[6]#f!g6M#s.u5）]（FS：For synthesis）

气相色谱0S,~.L1t3k7`-{"E （GC：Gas chromatography）

高压液相色谱 （HPLC：High Pressure Liquid chromatography）

指示剂9K5R-}-s;_9t分析化学,论坛,化学分析,仪器分析,分析测试,色谱,电泳,光谱 （Ind：Indicator）

红外吸收（IR）

液相色谱（LC）

核磁共振（NMR）

有机分析标准6a1Z2m:d*A7K+x分析化学论坛 （OSA：Organic analytical standard） 分析用（PA：Pro analysis）

实习用 （Pract： Practical use）

（\\（T&e- Y5G-N%MPur （Pure purum 纯） Puriss （Purissmum 特纯）

合成（SYN）

工业用Tech：Techincal grade）

薄层色谱（TLC：Thin Layer chromatography）

分光纯、光学纯、紫析分光光度纯$v7）（UV：Ultra violet pur