大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
原理
将质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞内的过程叫转化(Transformation)。受体细胞经过一系列处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许质粒分子进入的感受态细胞(Compenent cells) 。与电击法等其它方法相比,CaCl2制备法不但简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,若制备出的感受态细胞暂时不用时,即可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存半年以上,因此CaCl2法是分子生物学研究中最受欢迎的方法。 本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞,采用CaCl2法制备感受态细胞,并将pUC19 质粒转化至感受态细胞。进入受体细胞的质粒通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ) ,可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC19,则在含Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞(转化子)说明已导入了pUC19。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切、测序等进一步鉴定。
一、主要仪器、 材料和试剂
1. 仪器
移液器,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。
2. 实验材料
大肠杆菌E.coli DH5a 菌株,pUC19经实验1提取。
3. 试剂
⑴. 1 mol/L CaCl2
17.9g CaCl2·2H2O 溶于100ml 水中。
⑵. 100mg/ml 氨苄青霉素(ampicillin )
溶解1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水中,最后定容至10ml 。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml~50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
⑶. LB液体培养基:
蛋白胨(Tryptone ) 10g
酵母提取物(Yeast extract) 5 g
NaCl 10g ,
溶于800ml 去离子水中,用NaOH 调pH 至7.5,加去离子水定容至1升,高温高压灭菌20分钟。
⑷. LB固体培养基:液体培养基中每升加15g 琼脂粉,高温高压灭菌。
二、操作步骤
1. 受体菌的培养
从LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3 小时至OD600 ≈0.5 左右。
2. 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
⑴ 将培养液转入1.5ml 离心管中,冰上放置10 分钟,然后于4℃下6 000rpm 离心10 分钟。
⑵ 弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞, 冰上放置15-30 分钟后,4℃下6 000rpm 离心10 分钟。
⑶ 弃去上清, 加入4ml 预冷含15%甘油的0.05mol/L 的CaCl2 溶液, 轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
⑷ 感受态细胞分装成200μl 的小份,贮存于-70℃可保存半年。
3. 转化
⑴ 从-70℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。 ⑵ 加入pUC19 质粒DNA 溶液(含量不超过50ng ,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30 分钟后。
⑶ 42℃水浴中热激90秒或37℃水浴5 分钟,热激后迅速置于冰上冷却4分钟。
⑷ 向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp) ,混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
⑸ 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24 小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。
4. 计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此培养皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
三、思考题
1. 为什么采用E. coli DH5α常作为基因克隆中受体菌?
2. 本实验体系之外,其它的转化方法和筛选体系有哪些?