硫代葡萄糖苷的检测

硫代葡萄糖苷的测定

一、硫代葡萄糖苷的结构

硫代萄糖苷是一种含硫的阴离子亲水性植物次生代谢产物。1970年,Marsh和Waser等对硫代葡萄糖苷晶体的X射线分析证明: 所有的硫代葡萄糖苷都有一个核心结构是β-D-葡萄糖连接一个磺酸盐醛肟基团和一个来源于氨基酸的侧链。根据侧链R的氨基酸来源不同，可以将硫代葡萄糖苷分为脂肪族硫代葡萄糖苷（侧链来源于蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸），芳香族硫代葡萄糖苷（侧链来源于酪氨酸和苯丙氨酸）及吲哚族硫代葡萄糖苷（侧链来源于色氨酸）。不同的侧链决定了水解产物的不同,抗癌活性也存在差别。硫代葡萄糖苷的分类主要依据侧链R的不同。

二、硫代葡萄糖苷的性质

硫苷本身是一类稳定的化合物，但在芥子酶或胃肠道中的细菌酶的催化作用下会发生降解并生成多种降解产物。硫苷与芥子酶隔离共存于植物体内。当植物的器官受损或对植物加工时他们相接触导致硫苷降解。硫苷和它的降解产物都具有活跃的生物化学特性。

（1） 在食品中赋予产品特殊的风味，从而影响食物的适口性。如芥末辣根的辛辣味，雪菜味等。

（2）硫苷的降解产物如OZT及硫氰酸盐等，这些降解产物能抑制甲状腺素的合成和吸收，从而引起甲状腺肿大。

三、硫代葡萄糖苷在植物中的分布

在天然植物中已发现120多种不同的硫代葡萄糖苷，它们存在于11个不同种属的双子叶被子植物中，最重要的是十字花科，所有的十字花科植物都能够合成硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷存在于这些植物的根、茎、叶和种子中，但主要存在于种子中。另外，许多非十字花科的双子叶被子植物中也同样含有一种或两种硫代葡萄糖苷。硫代葡萄苷在一些十字花科植物中的含量大约占干重的1%，在一些植物种子中的含量达到10%。硫代葡萄糖苷在芸苔属蔬菜中的含量一般是500～2 000 μg/g,西兰花、花椰菜、甘兰分别含有5～6种以上的硫代葡萄糖苷，其中包括吲哚族硫代葡萄糖苷和芳香族的硫代葡萄糖苷。

四、硫代葡萄糖苷的测定

（一）、分光光度法

一、原理 ：

GS在蔬菜中内源酶----芥子酶的作用下水解产生葡萄糖，用3,5—二硝基水杨酸法测定所产生的葡萄糖量，计算出GS的含量。

二、仪器及试剂：

1、实验材料

(1)3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠、苯酚、无水葡萄糖、氟化钠、醋酸铅、硫酸钠。

(2)市售大头菜、油菜、白萝卜

2、仪器

(1)722分光光度计；(2)恒温水浴锅；(3)电炉；(4)刻度比色管；(5)容量瓶；(6)漏斗；(7)研钵；(8)温度计；(9)砧板、菜刀。

三、实验步骤

1、标准曲线的制作

（1）3,5-二硝基水杨酸的配置

取酒石酸钾钠182g及用3,5-二硝基水杨酸7g，加热溶解于500mL蒸馏水中，加入15g氢氧化钠，溶解后再加4g苯酚及1g无水亚硫酸钠，溶解后定容至1000mL，放置一周后备用。

（2）葡萄糖标准溶液的配置

取0.100g无水葡萄糖，蒸馏水溶解并定容至100mL，此溶液每mL含葡萄糖1.0mg

（3）葡萄糖标准曲线的绘制

取6支10mL刻度试管，依次加入葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,用蒸馏水补足至1mL，加入3,5-二硝基水杨酸溶液3mL混匀，于沸水浴中保温10min（使其完全反应）后取出，冷却至室温后定容至10.0mL，于530nm处测吸光度值，以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2、样品的酶解

选取大头菜表皮、中间、中心部位，油菜的根、茎、叶部位，萝卜的表皮、中间、中心部位，准确称取研磨每种样品0.500g两份，分别置于两支25mL刻度试管中，各加氟化钠0.1g。在一支试管中加沸水20mL,立即加热至沸并保持10min。在另一支试管中则加入35~38度蒸馏水20mL，置37度水浴中保温酶解1小时，使GS在芥子酶作用下水解。完成酶解后加热至沸并保持10min。

3、GS总量的测定

在两支试管中分别加入6滴中性醋酸铅，以沉淀其中的蛋白质及色素类物质，过量的醋酸铅应用饱和的硫酸钠溶液消除。最后，加蒸馏水定容至25mL，用滤纸过滤至试管中。取滤液各0.5，按葡萄糖标准曲线绘制方法，分别测定其吸光度。

四、GS总量的计算

GS=（m2-m1）×50×2.207／m×100％

式中: m1—灭酶管从标准曲线上查得的相应葡萄糖量，mg

m2—酶解管从标准曲线上查得的相应葡萄糖量，mg

m—样品质量，mg

2.207——是硫葡萄糖转化为硫葡萄糖苷的系数

五、误差分析

1、标准曲线的制作

绘制的标准曲线不过原点，可能是由于测量时参比溶液的配制不准确，引入了少量影响光吸收物质。

2、硫代葡萄糖苷含量的测定

测定结果中，有的测定值不合理。可能是在样品研磨中并转移至比色瓶过程中，由于研磨及在空气中停留时间过长，还有研磨时产生的热，使芥子酶作用于植物体，即灭酶处理的样品在灭酶前有部分葡萄糖苷已被酶解，缩小灭酶前后的差值及人为的偶然误差引起。

（二）、气相色谱法

一、试剂

DEAE-Sephadex A-25，Pharmacia进口分装；烯丙基硫甙，冰乙酸、醋酸铅、醋酸钡、乙腈、TMCS、吡啶均为AR，。

二、色谱分析条件

气相色谱采用氢焰离子化检测器；3mm1.6m玻璃柱，2％OV-1或2％OV-7固定液，Chromosorb W AW DMCS担体（60-80目）；程序升温：初始温度190摄氏度，终止温度280摄氏度，升温速率3摄氏度/min；进样口温度：300摄氏度；载气流速：N2 30ml/min，H2 50ml/min，空气500ml/min。高效液相色谱采用紫外检测器，检测波长220nm；4mm*250mm不锈钢柱，柱内填充YWG-C18H37(10um)；流动相为3％乙腈，流速2.5ml/min。

三、材料及样品的预处理和测定

1、DEAE-Sephadex A-25柱的制备：将5g DEAE-Sephadex A-25置于250ml烧杯中，加入50m1水，浸泡24小时以上备用。用玻璃纤维塞入8*150mm层析柱的底部，加入少量水于柱中，用滴管吸入少量浸泡好了的DEAE-Sephadex A-25，沿柱壁注入柱内，制成一个高约1mm的层析柱（相当于100mg），待水面快要接近柱面时，盖上塞子，以防水全部流干。

2、样品制备：准确称取脱脂样品

0.200g于10m1离心管中，加沸水4ml，在沸水浴中提取5分钟。冷后加入内标烯丙基硫甙标准溶液1m1(1.5umo1/ml)，摇匀。加0.5ml浓度为0.5mo1/L的Ba(Ac)2—Pb(Ac)2溶液，水浴上温热，稍冷后离心5分钟（3000r/min）。吸取上清液2.5m1放入DEAE-Sephadex A-25层析柱中，当柱子流干后，用2—5m1 0.02mol/L醋酸吡啶溶液洗涤一次，再用2—4ml水洗二次。加入lml 0.2％硫酸酯酶（H-1型），待近干时，塞紧塞子，放置过夜。每次用1ml水，连续淋洗色谱柱4次。将淋洗液合并，摇匀后供测

定用。

3、气相色谱测定和结果的计算：取2ml制备液在80℃水浴锅中，用旋转蒸发器蒸干或放在衍生管中，在100以下放有干燥硅胶的烘箱中烘干。加入吡啶100ul，BSTFA 1001，TMCS 10ul。塞紧瓶塞，振动摇匀。在120℃保温20分钟，制备衍生物。取1ul按气相色谱条件进样分析。

四、计算结果

(三)、高效液相色谱法

一、原理

用70% 甲醇水溶液提取硫代葡萄糖苷，然后在阴离子交换树脂上纯化，并酶解脱去硫酸根，反相色谱柱分离，紫外检测器检测硫代葡萄糖苷。

二、试验材料

转基因油菜籽及其产品、受体油菜籽及其产品。如果对转基因油菜籽产品中的硫代葡萄糖苷进行测定，转基因油菜籽产品和受体油菜籽产品的处理条件应相同。

三、仪器和试剂

仪器：1、研钵或微型研磨机； 2、聚丙烯离子交换微柱：底部筛板为100目； 3、离心机：带有10 mL转头，并能获得5000 g的相对离心力； 4、0.45 μm水溶性微孔滤膜； 5、高效液相色谱仪：具备梯度洗脱，柱温可控制在30℃，带紫外检测器；

6、色谱柱：填料颗粒小于或等于10 m的反相 C18或C8柱，例如：Novapak C18柱，5 m（150 mm×3.9 mm）；Lichrosorb Rp18柱，5 m（150 mm×4.6 mm）；Spherisorb C18柱，10 m（150 mm×4 mm）；Lichrospher Rp8柱，5 m（125 mm×4 mm）。 试剂：除非另有说明，仅使用分析纯试剂；水为蒸馏水。

1、硫酸酯酶溶液：Helix pomatia H1型（EC 3.1.6.1），每毫升硫酸酯酶溶液的活性单位不低于0.5，硫酸酯酶溶液应即配即用。

2、葡聚糖凝胶悬浮液：称取10 g DEAE Sephadex A 25葡聚糖凝胶，浸泡在过量的2 mol/L醋酸溶液中，静置沉淀，再加入2 mol/L醋酸溶液，直到液体体积是沉淀体积的2倍，于4℃冰箱中存放，待用。

3、70%甲醇溶液：取70 mL甲醇，加水定容至100 mL。

4、0.02 mol/L醋酸钠溶液：称取0.272 g醋酸钠（CH3COONa·3H2O），加入800 mL水溶解，用醋酸调节溶液的pH值至4.0，加水定容至1 L。

5、6 mol/L甲酸咪唑溶液：称取204 g咪唑，溶解于113 mL甲酸中，待溶液冷却后加水定容至500 mL。

6、内标：用丙烯基硫代葡萄糖苷（Mr=415.49）作内标，当样品中含有丙烯基硫代葡萄糖苷时，用苯甲基硫代葡萄糖苷（Mr=447.52）作内标。对硫代葡萄糖苷含量低于20.0 mol/g的样品，可将下述中的内标溶液浓度降为1 mmol/L至3 mmol/L。内标溶液在4℃的冰箱中可存放三周，在-18℃条件下可保存更长时间。

（1）5 mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取207.7 mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80 mL水中，加水定容至100 mL。

（2）20 mmol/L丙烯基硫代葡萄糖苷溶液：称取831.0 mg丙烯基硫代葡萄糖苷溶解于80 mL水中，加水定容至100 mL。

（3）5 mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取223.7 mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于8 0mL水中，加水定容至100 mL。

（4）20 mmol/L苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：称取895.0 mg苯甲基硫代葡萄糖苷溶解于80mL水中，加水定容至100 mL。

（5）流动相A：超声波脱气30s的水。

（6））流动相B：取200 mL色谱级乙腈，加入800 mL水，浑匀，超声波脱气30s。

四、操作步骤

（一）、试样的制备

如果试验材料的水分及挥发物含量超过10%，应在45℃条件下通风干燥，并将干燥后的待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40目筛，然后立即连续完成第四步的1和2。

（二）、称样： 分别称取200.0 mg待测试样至A、B两支离心管中。

（三）、硫代葡萄糖苷的提取

1、将离心管75℃水浴1 min，加入2 mL 70％ 沸甲醇溶液后，立即加入200 L 5 mmol/L内标溶液至A管中，200 L 20 mmol/L内标溶液至B管中。

2、75℃水浴10 min，其间每隔2 min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温， 5000 g离心3 min，分别转移上清液至10 mL刻度试管A＇、B＇中。

3、分别向A、B管中再加入2 mL 70％沸甲醇溶液，75 ℃水浴约30 s，旋涡混匀后，75 ℃水浴10 min，其间每隔2 min取出离心管旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温， 5000 g离心3 min，分别转移上清液至原刻度试管A＇、B＇中。

4、用水调节A＇、B＇管中的提取液至5 mL，混匀。此提取液在-18 ℃暗处可保存2周。

（四）、离子交换微柱的制备

每一个试样提取液准备一支聚丙烯离子交换微柱，垂直置于试管架上。取0.5 mL充分混匀的葡聚糖凝胶悬浮液至每一离子交换微柱中，注意不要使悬浮液粘附在柱壁。静置待液体排干后，取2 mL 6 mol/L甲酸咪唑溶液冲洗树脂，排干后，再用1 mL水冲洗树脂两次，每次均让水排干。

（五）、色谱条件

仪器条件：流动相流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，紫外检测器检测波长229 nm，进样量10 L，记录峰面积。

五、结果表示

单组分硫代葡萄糖苷含量的计算：以每克干基脱脂油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微摩尔数表示，

Ag

Asnm11wD1 =

式中： Kg

D1 － 干基脱脂油菜籽中硫代葡萄糖苷含量，单位为微摩尔每克（mol/g）； Ag — 脱硫硫代葡萄糖苷峰面积；

As — 内标峰面积；

Kg — 脱硫硫代葡萄糖苷相对校正系数，m — 试样质量，单位为克（g）； n — 试样中加入内标的量，单位为微摩尔（mol）；

w — 试样中水分、挥发物和含油量之和，以质量百分数表示（％）。

计算结果表示到小数点后两位。