精细定位和候选基因预测

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 水稻抽穗期QTL DTH2的精细定位和候选

基因预测

吴玮勋1，江玲1，陆广文1，钟铮铮2，万建民15 （1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；

2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）

摘要：抽穗期是水稻中的一个重要性状，决定水稻适应不同的栽培地区和播种季节。本文中，我们发现了一个新的微效QTL DTH2，仅在长日照条件下促进开花。DTH2的遗传效应最初在染色体片段置换系23（CSSL23）中确定，然后用CSSL23/Asominori BC4F 2群体对该QTL 进行定位。用标记辅助选择的方法从BC 4F 2群体中开发了一个近等基因系（NIL ）。通过图位克隆的方法我们把DTH2定位在37.6-Kb 的基因组范围内，其间有9个预测的开放阅读框（ORFs ），其中ORF5和拟南芥COL9有51%氨基酸序列的同源性，后者通过降低CO 和FT 的表达从而在拟南芥中长日照条件下延迟开花。我们于是推测ORF5是候选基因。该研究为图位克隆DTH2基因提供了基础。

关键词：水稻；DTH2；抽穗期；微效QTL

中图分类号：S511.S330.2+5

10 15

20 WU Weixun1, JIANG ling1, LU Guangwen1, ZHONG Zhengzheng2, WAN Jianmin1

(1. State Lab of Crop Genetics and Germplasm Ehancement, Nanjing Agricultural University,

NanJing 210095;

2. Cro Science Institute, CAAS, Beijing 100081)

Abstract: Heading date (HD) in rice is a key determinant for its adaptation to different cultivation zones and cropping seasons. Here, we discover a newly identified minor-effect QTL DTH2, which promotes flowering only under long-day conditions (LDs). A genetic effect of dth2 was first confirmed in the chromosome segment substitution line 23 (CSSL23), then the QTL was mapped using the CSSL23/Asominori BC4F 2 population. One nearly isogenic line (NIL) was developed from the BC4F 2 population using a marker-assisted selection strategy. Map-based cloning located the DTH2 in a 37.6-kb genomic region with 9 predicted open reading frames (ORFs), of which ORF5 showed 51% amino-acid-sequence identity with the Arabidopsis COL9, which delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis only under long-day conditions. We speculated that ORF5 was the candidate gene. This study provides a basis for map-based cloning of the DTH2 gene.

Keywords: Rice; DTH2; Heading date; Minor-effect QTL

Fine mapping of the heading date QTL DTH2 and prediction of candidate gene in rice (Oryza sativa L.) 25 30 35

0 引言

在水稻中，抽穗期是一个重要的农艺性状，它决定着品种的季节和区域适应性。因此，选择合适的抽穗期是水稻育种中的主要任务。抽穗期是水稻中的一个复杂性状，由许多基因40 和环境条件如温度和日长控制。在这些环境条件中，光周期是一个最主要的因素。最近的

QTL 研究发现许多基因控制抽穗期，许多抽穗期QTL 在目标群体中发生分离。截至2012年9月底，根据Gramene 网站(http://www.gramene.org/qtl/)公布的数据，目前和水稻抽穗期相关的QTL 有618个，分布于水稻各条染色体上。然而，在这些研究中，大多数QTLs 仅基金项目：教育部博士点基金（[1**********]011）

作者简介：吴玮勋，（1985-），男，博士研究生，水稻分子遗传学。

通信联系人：万建民，（1960-），男，教授，水稻遗传育种。E-mail: [email protected]

45 初步定位，它们的高精密图谱仍然未知，限制了对其进行进一步图位克隆。 初级定位群体如F 2群体，回交群体（BC ），双单倍体群体（DH ）和重组自交系群体

（RILs ）不利于精细定位QTLs ，因为许多基因在全基因组水平同时发生分离[1]。目前主要利用各种突变体和品种间的自然变异来进行抽穗期的遗传研究，此外，染色体片段置换系（chromosome segment substitution lines, CSSLs）和近等基因系（nearly isogenic lines, NILs）是进行QTL 检测和分离的良好材料[2-3]。通过使用NIL 的策略，至少9个抽穗期QTLs （Hd1, 50 其中5个QTLs (Hd1, Hd2, Hd3a, Hd3b, Hd6, Hd8, Hd9, Ehd1和DTH8）已经被精细定位[1,4-11]，

Hd3a , Hd6, Ehd1和DTH8) 被成功克隆[10-14]。此外，用相同的策略，最近研究发现Ghd7是同时调控水稻抽穗期、株高和产量的重要基因[15]。

研究发现水稻（短日植物）和拟南芥（长日植物）中，参与光周期调控的主要基因高度保守[16]。拟南芥中的GI , CO 和FT 在水稻中的同源基因分别是OsGI , Hd1和Hd3a [12,14]。然55 而Hd1在长日条件下抑制开花但在短日条件下促进开花，而CO 仅在长日条件下促进开花。

另外许多开花通路在水稻和拟南芥中是惟一的，如水稻中的Ehd1通路[10]。

本研究的目的如下：（1）分析CSSL23晚抽穗表型的遗传基础；（2）把QTL DTH2分解成单个基因；（3）把DTH2限定在一个尽可能小的基因组范围之内；（4）对QTL DTH2 的候选基因进行预测。

60 1 材料与方法

1.1 NIL的分离

Asominori （Aso ）是来自日本的粳稻品种，IR24是国际水稻所育成的籼稻品种。Kubo 等[3]通过Aso 和IR24的杂交和一系列的回交构建了66个CSSLs 。具体构建过程为：Aso 和

挑选其中19个RILs 和Aso 回交至BC 3F 1IR24杂交后通过一粒传的方法获得了71个F 7 RILs，

65 代，从中挑选了66个以Aso 背景的CSSLs ，基本覆盖水稻12条染色体。通过调查抽穗期，

我们发现其中有一个染色体片段置换系，CSSL23，在北京田间自然长日照（NLDs ）条件下比背景亲本Aso 延迟抽穗1周左右，而在海南田间自然短日照（NSDs ）条件下两者差异不显著。为了进一步减少CSSL23中的来自IR24的插入片段，我们通过使CSSL23和Aso 杂交，然后再和Aso 回交四代后自交产生一个包含374个单株的CSSL23/Aso BC4F 2群体，从70 中分离出了一个以Aso 为背景，包含DTH2位点的9.6-cM （厘摩）来自IR24片段的NIL 。

该IR24片段限定于第二染色体SSR 标记RM318和RM240之间。

1.2 田间栽培

Aso 和NIL 栽培在北京中国农科院作物所东门网室自然长日照条件下（NLDs ，东经116.4°，北纬39.9°，日长>15h）田间，海南三亚中国农科院南滨农场自然短日照条件下（NSDs ，75 东经110.0°，北纬18.5°，日长

株，收种后种植4312个NIL×Aso F2:3家系，即每个F 2单株收的种子种两行，每行10株，共86240个单株。各种转基因植株种植在北京NLDs 。

1.3 控制条件下栽培

光照培养箱控制的短日照条件（Controlled short-day conditions, CSDs, 10h光, 30°C/14h80 暗, 25°C），光照培养箱控制的长日照条件（Controlled long-day conditions, CLDs, 14h光,

30°C/10h暗, 25°C）。光照培养箱用荧光灯照明（300μmol m-2 s-1），湿度为70%。

1.4 抽穗期调查 抽穗期指单株的第一个穗子抽出的日期；抽穗期天数指单株自播种到第一个穗子抽出的天数；晚抽穗家系指一个随机家系中大部分单株抽穗都相同或晚于亲本NIL 的家系。分单85 株调查，单株第一个穗子的穗尖露出叶鞘1cm 记为该单株抽穗，每两天调查一次。Aso ，NIL

及各种转基因植株的抽穗期为若干单株抽穗期的平均值。

1.5 DNA提取和PCR 扩增

用CTAB 法提取水稻基因组DNA 。PCR 反应体系为20μl ，其中包括2μl DNA工作液，10μM/L的上下游引物各1μl ，1μl 10mM dNTP，1×buffer (Mg2+ plus)和0.2μl rTaq DNA聚合90 酶(Takara, Japan)。在Biometra 070-951 PCR仪中进行。反应条件为98℃预变性3min ，94℃

变性30s ，55℃退火30s ，72℃延伸1min ，共进行35次循环，最后72℃延伸7min 。扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）上分离后进行银染[17]。

1.6 QTL分析及分子标记开发

用QTL IciMapping v2.1软件[18]对CSSL23/Aso BC4F 2群体进行抽穗期QTL 分析，LOD 95 值取3.0作为是否有QTL 存在的临界值，LOD>3.0即说明存在QTL 。分离出包含来自IR24

的DTH2的NIL 后，构建NIL×Aso F2:3家系，从4312个家系中挑选晚抽穗家系，利用在Nature （2005）公布的SSR 引物中选择介于标记RM318和RM240之间的在Aso 和IR24有多态的SSR 引物，采用隐性极端个体基因作图方法[19]对DTH2进行定位。之后从Gramene 网站（http://www.gramene.org/）下载介于初定位区间的日本晴序列，与已测序的籼稻9311序列100 进行比对，设计SSR 或InDel 标记，或利用dCAPS Finder 2.0

（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）设计dcaps 引物，引物设计利用Primer Premier 5.0 进行。本实验中用到的定位引物见附表1。

1.7 候选基因预测与测序分析

利用美国基因组研究所的水稻基因组注释计划（Rice Genome Annotation Project, RGAP, 105 http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）和日本水稻注释计划数据库（Rice Annotation

Project Database, RAP-DB, http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）对DTH2所在的37.6-Kb 区段进行基因预测。并对比美国国立生物技术信息中心（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的在此区段的基因信息，选择三大数据库共有的基因作为候选基因。从NCBI 中下载该基因的日本晴序列，设计引物分别对两亲本Aso 和NIL 的编110 码区（Coding region）进行分段PCR 扩增，每段为1.2Kb 左右，PCR 产物割胶回收后交与

北京博迈德生物技术有限公司测序。对于直接测序结果不好的样品可重新设计引物或对PCR 产物回收后连载体测序，回收采用TIANGEN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，载体用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Kit。对两亲本的测序结果用Powerblast 软件进行序列比对，候选基因进一步锁定在两亲本编码区中编码序列（Coding 115 sequence, CDS）有差异的基因中。

2 结果与分析

2.1 抽穗期QTL 分析和NIL 的分离

本实验室之前的研究利用一个来源于Asominori （Aso ，粳稻）和IR24（籼稻）的重组

120 自交系（RILs ）群体，连续5年在第二染色体长臂末端标记C601附近检测到一个微效抽穗期QTL [20]，名为qDTH-2（QTL for Days to heading on chromosome 2, 在此研究中命名为

DTH2）。由于RILs 遗传背景复杂，对于遗传效应较小的QTL 很难定位，而利用遗传背景高度一致的近等基因系（NILs ）或染色体片段置换系（CSSLs ）来定位抽穗期微效QTL 有很大优势。为了研究DTH2在抽穗期中的遗传效应并最终分离它，我们利用了一个染色体片段置换系CSSL23，通过构建一个包含374个单株的CSSL23/Aso BC4F 2群体，我们从中分125 离了一个以Aso 为背景，包含DTH2位点的9.6-cM 来自IR24插入片段的NIL ，位于标记

RM318和RM240之间（图1）。

130 图1 NIL中的DTH2位于第二染色体上的连锁图。左边是相邻SSR 标记之间的基于物理距离的图距（cM ），右边是标记的名称。来自IR24的插入片段以黑柱子显示，背景为Aso 。

Fig. 1 Linkage map of DTH2 on chromosome 2 in the NIL. Map distances (cM) based on physical distance between the adjacent SSR markers are shown on the left. Names of markers are shown on the right. The insertion

segment from IR24 is denoted by the black bar in the Aso background.

2.2 表型描述

135 在北京自然长日照条件下（NLDs ，日长>15 h），和Aso 比相比，NIL 延迟7.4天抽穗，

但在海南自然短日照条件下（NSDs ，日长

140 表1 Aso和NIL 在不同条件下的抽穗期。

Table 1 Measurements of days to heading of Aso and NIL under different conditions.

Genotype LongitudeLatitude Condition N No. of Days P

to Headingc

Asominori in Beijing 116.4° E 39.9 ° N15.4h L 28126.21 ± 0.40 1.64×10

NIL(DTH2) in Beijing 8.6h D 28133.64 ± 0.71

Asominori in Hainan 110.0° E 18.5° N11.6h L 1073.50 ± 0.48 0.40

NIL(DTH2) in Hainan 12.4h D 1074.20 ± 0.65 a L 和D 分别表示不同条件下的光期和暗期长度，用于统计抽穗期的植株数，数据用平均值±标准误差显示，d P 代表双尾T 测验的P 值。 a L and D indicate the length of light and dark of the planting condition, respectively; b Number of the plants measured for days to heading; c Data are presented as mean ± s.e.m; d P value produced by two-tailed Student's t -test. 145

150

155 图2 在CLDs 下，从第2周到第14周的Aso 和NIL 的出叶速率的比较（A ）；及在CSDs 下，两者从第2周到第8周出叶速率的比较（B ）。出叶速率统计根据之前发表的方法[21]。实验经过两次生物学重复。本实验中用到的Aso 和NIL 均为18株，数据用平均值±标准偏差显示。 Fig. 2 The leaf emergence rate between Aso and NIL until 14 weeks under CLDs (A) or 8 weeks under CSDs (B). Leaf emergence rate was measured according to the method described periously[21]. The filled and dotted arrowheads indicate the average number of days to heading for Aso and NIL, respectively. The dates were obtained from two biological repeats. Number of plants used in the test is 18 for both Aso and NIL. All data are

given as mean ± s.d.

2.3 DTH2的精细定位

分离出NIL 后，我们下一步想研究DTH2是否是一个单孟德尔因子，于是我们做了遗传分析。通过调查Aso 和NIL 杂交形成的F 2群体的抽穗期，结合分子数据，我们发现早抽160 穗和晚抽穗的分离比大约为3:1（3213:1099, χ2 = 0.55, P = 0.46），表明DTH2是一个单孟德

尔因子。由于DTH2是一个微效QTL ，只有一周左右的表型差异，使我们在用极端隐性个体定位的时候很容易取到杂合型的个体以致影响定位结果。因此我们用F 2衍生家系（F 2:3）的平均表型值来鉴定抽穗期，以此来使表型容易鉴定并最终图位克隆DTH2。为了精细定位DTH2，我们使Aso 和NIL 杂交，得到F 1后使之自交得到4312株F 2植株，然后再繁育成165 4312个F 2:3家系群体，包含86240个单株。在这4312 F2:3家系中，我们选择了1099个晚抽

穗的纯合家系用于定位DTH2（图3）。首先在标记RM318和RM240处分别找到了21和190个交换单株（图4A ）；随后根据Nature （2005）公布的SSR 引物中选择介于标记RM318和RM240之间的在Aso 和IR24有多态的7对SSR 引物将DTH2定位在RM13910和RM13924之间，各有2个和8个交换单株（图4B ）；进一步开发了2对indel 引物，2对dcaps 引物170 和一对caps 引物将DTH2定位在dcaps3和dcaps5之间的37.6Kb 的区间内，各有两个交换

单株，和caps1共分离，位于PAC 克隆AP005113上（图4B, C）。

175 图3 Aso和NIL 杂交得到的F 2:3家系群体中三种家系的开花范围（A ）和抽穗期（B ）。N 代表家系数。数据用平均值±标准误差显示。

Fig. 3 The flowering ranges (A) and days to heading (B) of the three kinds of families from the F2:3 populations derived from a cross of Aso and NIL. N represents numbers of families used in the study. Data are presented as

mean ± s.e.m.

180

185

190 图4 DTH2的图位克隆。（A ）DTH2位点被定位在第2染色体长臂标记RM318和RM240之间。在A 图和B 图中标记下的数字表示交换单株数。（B ）用1099个隐性家系精细定位DTH2位点。DTH2位点最终被限定在位于标记dcaps3和dcaps5的37.6Kb 的区间内。（C ）在标记dcaps3和dcaps5之间预测有9个开放阅读框，位于日本晴PAC 克隆AP005113上，箭头表示相应基因的位置。（D ）图示DTH2编码区结构及Aso (DTH2-a ) 和NIL (DTH2-i ) 等位基因之间的自然变异。在编码序列中发现4个SNPs (S1和S4) 。长方形和线分别代表外显子和内含子。 Fig. 4 Map-based cloning of DTH2. (A) The DTH2 locus was mapped between the markers RM318 and RM240 on the long arm of chromosome 2. The number below the marker name in A and B denotes the recombinants. (B) Fine mapping of the DTH2 locus using 1099 recessive families. The DTH2 locus was delimited to a 37.6-Kb genomic region between the markers dcaps3 and dcaps5. (C) Nine ORFs were predicted between the dcaps3 and dcaps5 markers, located on Nipponbare PAC clone AP005113, and the arrowhead indicates the gene location. (D)

A diagram showing the coding region structure of DTH2 and natural variations between the Aso (DTH2-a ) and NIL (DTH2-i ) alleles. Four SNPs (S1-S4) in coding sequence were identified and shown. Rectangles and lines

represent exons and introns, respectively.

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2.4 DTH2的候选基因预测

195 http://www.paper.edu.cn 根据美国基因组研究所的水稻基因组注释计划（Rice Genome Annotation Project, RGAP,

http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml），在此区间有9个预测的开放阅读框（ORFs ）（表2）。其中ORF5 (LOC_Os02g49230)预测编码一个CONSTANS-like (CO-like)蛋白，和拟南芥开花基因COL9高度同源，COL9在拟南芥中长日条件下抑制开花[22]。水稻基因组中还存在一个和ORF5紧密相关的基因OsM (LOC_Os06g19444)，和ORF5有76% 氨基酸序200 列的一致性。目前研究表明CO -like 基因广泛参与高等植物的光周期开花调控[23,24]，并且在

ORF5的Aso 等位基因（DTH2-a ）和IR24的等位基因（DTH2-i ）的编码序列中检测到4个单核苷酸多态性（SNPs ）位点（图4D ）。在水稻已克隆抽穗期基因中，Hd1，Ghd7，OsCOL4和OsCO3都属于CO -like 基因家族[12,15,25,26]。综上所述，ORF5极有可能就是目的基因。

205 表2 利用水稻基因组注释计划预测到的位于DTH2位点的基因。

Table 2 Predicted genes at the DTH2 locus based on online analysis using the Rice Genome Annotation Project. ORF2 LOC Os02g49200 Hypothetical protein

ORF3 LOC_Os02g49210 Hypothetical protein

ORF4 LOC Os02g49220 Hypothetical protein

ORF5 LOC_Os02g49230 CCT/B-box zinc finger protein, putative, expressed

ORF6 LOC_Os02g49240 Conserved hypothetical protein, expressed

ORF7 LOC Os02g49244.1 Conserved hypothetical protein, expressed

ORF8 LOC_Os02g49250.1 Myb-like DNA-binding domain containing protein

ORF9 LOC_Os02g49260.1 Similar to transporter-related, putative, expressed

3 讨论

抽穗期基因大多是数量性状基因，表型受环境的影响较大。之前克隆的QTLs 如Hd1，210 Ehd1和Ghd7影响开花时间具有相对大的效应[10,12,15]。在本文研究中，我们发现DTH2影响

水稻抽穗期的效应较小（大约一周，表1），属于微效QTL 。目前抽穗期QTLs 位点的检测和定位所用的群体主要是BC 、DH 、RILs 以及F 2等初级群体，这些群体遗传背景复杂，对于遗传效应较小的QTLs 很难定位，而利用遗传背景高度一致的NILs 或CSSLs 来定位抽穗期微效QTLs 有很大优势。

215 为了研究DTH2在抽穗期中的遗传效应并最终分离它，我们首先利用一个来源于Aso

和IR24的RILs 群体在第二染色体长臂末端标记C601附近检测到该QTL [20]，然后使用了一个以Aso 为遗传背景插入供体亲本IR24染色体片段的染色体片段置换系CSSL23，通过构建一个包含374个单株的CSSL23/Aso BC4F 2群体，我们从中分离了一个以Aso 为背景，包含DTH2位点的9.6-cM 来自IR24插入片段的NIL ，位于标记RM318和RM240之间（图1）。220 由于DTH2是一个微效QTL ，只有一周左右的表型差异，使我们在用极端隐性个体定位的

时候很容易取到杂合型的个体以致影响定位结果。因此我们用F 2衍生家系（F 2:3）的平均表型值来鉴定抽穗期，以此来使表型容易鉴定并最终图位克隆DTH2。因此利用NIL 和F 2:3家系的方法是定位微效QTLs 的有效途径。

4 结论

225 本文发现了一个新的微效QTL DTH2，仅在长日照条件下促进开花。其遗传效应最初在

染色体片段置换系 CSSL23中确定，然后用CSSL23/Asominori BC4F2群体对该QTL 进行精细定位。将DTH2定位在37.6-Kb 的基因组范围内，其间有9个预测的开放阅读框（ORFs ），

中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn 其中ORF5和拟南芥COL9有51%氨基酸序列的同源性，后者通过降低CO 和FT 的表达从而在拟南芥中长日照条件下延迟开花。

230 致谢

日本九州大学Atsushi Yoshimura博士提供CSSL 群体，特致谢意。

[参考文献] (References)

235

240

245

250

255

260

265

270

275

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