成骨细胞各因子的检测方法

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中国骨质疏松杂志　２０１３年１０月第１９卷第１０期　ＣｈｉｎＪＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓꎬＯｃｔｏｂｅｒ２０１３ꎬＶｏｌ１９ꎬＮｏ.１０

Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅｗｗｗ.ｗａｎｆａｎｇｄａｔｅ.ｃｏｍ.ｃｎ　ｄｏｉ:１０ ３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６￣７１０８ ２０１３ １０ ００３

论著

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１增殖、分

化的影响

１.江苏大学附属医院骨一科ꎬ镇江　２１２００１３.美国纽约大学医学院ꎬ美国纽约

赵国阳１　何银锋２　李光飞２　ＸｉＨａｎｇ３　徐又佳２∗

２.苏州大学附属第二医院骨科ꎬ苏州　２１５００４

中图分类号:Ｒ６８１　　文献标识码:Ａ　　文章编号:１００６￣７１０８(２０１３)１０￣１０２２￣０４

摘要:目的　观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１增殖、分化指标的变化趋势ꎬ探讨铁离子对成骨细胞增殖、分化的影响ꎮ方法　小鼠前成骨样细胞ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１在３７℃条件下体外培养ꎬ在１０ｍｍｏｌ/Ｌβ￣甘油磷酸和５０μｇ/ｍＬ抗坏血酸的诱导分化的作用下ꎬ分化为成骨细胞ꎬ同时用不同浓度(５０、１００、２００μｍｏｌ/Ｌ)枸橼酸铁铵(ＦＡＣ)干预ꎬ用ＭＴＴ法检测细胞的增殖活性ꎬＲＴ￣ＰＣＲ法检测成骨细胞分化基因成骨相关转录因子(Ｒｕｎｘ２)、锌指结构转录因子(Ｏｓｔｅｒｉｘ)、骨唾液酸蛋白(ＢＳＰ)和骨钙素(ＯＣ)的表达ꎬ碱性磷酸酶(ＡＬＰ)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性ꎮ结果　ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的表达以及ＡＬＰ水平随ＦＡＣ干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(Ｐ

ＥｆｆｅｃｔｏｆｅｘｃｅｓｓｉｒｏｎｃｕｌｔｕｒｉｎｇｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　

１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓꎬｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｅｎｇｊｉａｎｇ２１２００１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮＹＵＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮＹ１００１６ꎬＵ.Ｓ.Ａ.Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＸＵＹｏｕｊｉａꎬＥｍａｉｌ:ｘｕｙｏｕｊｉａ＠ｍｅｄｍａｉｌ.ｃｏｍ.ｃｎＺＨＡＯＧｕｏｙａｎｇ１ꎬＨＥＹｉｎｆｅｎｇ２ꎬＬＩＧｕａｎｇｆｅｉ２ꎬＸｉＨｕａｎｇ３ꎬＸＵＹｏｕｊｉａ２

２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓꎬｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｏｏｃｈｏｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｕｚｈｏｕ２１５００４ꎬＣｈｉｎａ

Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｈａｎｇｉｎｇｐａｔｔｅｒｎｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉａｌｉｎｄｅｘｅｓｏｆｍｏｕｓｅＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｅｘｃｅｓｓｉｒｏｎꎬａｎｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｒｏｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ.ＭｅｔｈｏｄｓａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄꎬＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｉｎｔｏｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ.Ｍｅａｎｗｈｉｌｅꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ(５０ꎬ１００ꎬａｎｄ２００μｍｏｌ/ＭｏｕｓｅＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄａｔ３７℃ｉｎｖｉｔｒｏ.Ｕｎｄｅｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ１０ｍｍｏｌ/ｌβ￣ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅａｎｄ５０μｇ/ｍｌＬ￣ｌ)ｏｆＦＡＣｗｅｒｅａｄｄｉｔｉｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ.ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇＭＴＴｍｅｔｈｏｄ.ＴｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＲｕｎｘ２ꎬＯｓｔｅｒｉｘꎬｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ(ＢＳＰ)ꎬａｎｄｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ(ＯＣ)ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇＲＴ￣ＰＣＲ.ＡＬＰａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＯＣꎬａｎｄＡＬＰａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆＦＡＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬｓｈｏｗｉｎｇａｄｏｓｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ(Ｐ

ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇＡＬＰｖｉａｂｉｌｉｔｙｋｉｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｃｅｌｌｓꎬｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＲｕｎｘ２ꎬＯｓｔｅｒｉｘꎬＢＳＰꎬ

　　目前ꎬ铁过载对骨关节系统影响的研究已成为

一个新的热点ꎮ我们以前的多项研究表明ꎬ铁过载

基金项目:国家自然科学基金(８１２７３０９０)ꎻ江苏省自然科学基金(ＢＫ２０１２６０８)ꎻ苏州市科技基础设施建设计划之高技术研究重点实验室资助项目(ＳＺＳ２０１２２０８)ꎻ苏州市应用基础研究计划之医疗卫生部分资助项目(ＳＹＳ２０１００２)

∗通讯作者:徐又佳ꎬＥｍａｉｌ:ｘｕｙｏｕｊｉａ＠ｍｅｄｍａｉｌ.ｃｏｍ.ｃｎ

可抑制骨形成ꎬ促进骨吸收ꎬ是骨质疏松的危险因素[１￣３]ꎮ而在骨发育过程中ꎬ干细胞或前体细胞向成熟的成骨细胞分化非常重要ꎮ但是ꎬ铁过载对成骨细胞分化的影响如何却不十分明确ꎮ本研究以小鼠前体成骨样细胞ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１为研究对象ꎬ用不同浓度的枸橼酸铁铵加入培养基中造成高铁培养环境ꎬ观察高铁环境对ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞增殖和分化过程中

中国骨质疏松杂志　２０１３年１０月第１９卷第１０期　ＣｈｉｎＪＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓꎬＯｃｔｏｂｅｒ２０１３ꎬＶｏｌ１９ꎬＮｏ.１０

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相关基因表达以及碱性磷酸酶活性的影响ꎬ旨为高铁环境对成骨细胞影响的研究补充实验依据ꎮ

Ｂｕｆｆｅｒ４μＬꎬ１０ｍｍｏｌ/ＬｄＮＴＰＭｉｘ２μＬꎬＲｉｂｏｌｏｃｋＴＭ

１　材料和方法

１ １　主要材料、仪器

小鼠前体成骨样细胞ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１(中科院上海细胞库)ꎬ枸橼酸铁铵(ＦＡＣꎬ国药集团化学制剂有限公司)ꎬ改良型α￣ＭＥＭ(美国Ｇｉｂｃｏ公司)ꎬ新生胎牛血清(美国Ｇｉｂｃｏ公司)ꎬＭＴＴ检测试剂盒(美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎬＴｒｉｚｏｌ(美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司)ꎬ碱性磷酸ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ(２０μ/μＬ)１μＬꎬＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＭ￣ＭμＬＶＲｅｂｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ(２００μＵ/μＬ)１μＬꎬ补加ＤＥＰＣ水至２０μＬꎮ于热循环仪中６５℃５ｍｉｎ预变性ꎬ４２℃６０ｍｉｎ逆转录ꎬ７０℃５ｍｉｎ终止反应ꎮ聚合酶链反应的总反应体积为２０μＬ:内含２×ＴａｑＰＣＲｍｉｘ１０μＬꎬＷａｔｅｒ(ｎｕｃｌｅａｓｅ￣ｆｒｅｅ)７μＬꎬ上下游９４℃３ｍｉｎꎬ９４℃３０ｓꎬ５５℃３０ｓꎬ７２℃３０ｓꎬ共３３个循环ꎮ引物根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ与Ｐｒｉｍｅｒ３设计ꎬ由上海引物各１μＬꎬ逆转录产物１μＬꎮＰＣＲ反应条件:

酶试剂盒(南京建成公司)ꎬＢＣＡ蛋白试剂盒(碧云天公司Ｇｅｎｅ司)ꎬ电泳仪Ａｍｐ)ꎬ高ＰＣＲ速冷(Ｂｉｏ￣ＲａｄꎬＳｙｓｔｅｍ冻离心ＰｏｗｅｒＰＰＡＣ２００ꎬ９７００机(ＰＣＲ美国仪Ｔｈｅｒｍｏ(美美国国公)ꎮＡＢＩ司)ꎬ公１ ２　实验方法

１ ２ １　ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞培养:小鼠ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞置于５％ＣＯ良型ｍＬ２~３和链霉素α￣ＭＥＭꎬ２、３７℃换液１１００含１０％培养箱内培养ꎬ细胞培养基为改次ꎬ细胞密度长至μｇ/的胎牛血清ｍＬꎮ根据细胞的培养情况每、青霉素１００μｇ/传代ꎮ

ｄ７０％~８０％时进行１ ２ ２　细胞增殖检测:采用ＭＴＴ法ꎮ９６孔板接种细胞ꎬ每孔２０００个ꎮ细胞贴壁后更换培养液并加入终浓度为１０ｍｍｏｌ/Ｌβ￣甘油磷酸钠和５０μｇ/ｍＬ抗２００坏血酸ꎬ同时分别加入不同浓度的ＦＡＣ(０、５０、１００、

等量培养基μｍｏｌ/Ｌ)ꎬꎮ对照组细胞分为(０４μｍｏｌ组ꎬ每组/Ｌ)加入不含５孔ꎮ干预ＦＡＣ２４的ｈ后ｈꎬꎬ加入ＭＴＴ１０吸去孔内液体液(５ｍｉｎꎬ用酶标仪选择ꎬ加入ｍｇ/ＤＭＳＯｍＬ)２０５７０ｎｍ液体μＬ波长测定各孔吸光

１５０/孔ꎬ３７℃μＬ/孔孵育ꎬ振荡４值ꎬ其值与细胞数量成正比ꎮ

１ ＰＣＲ２ ３　细胞分化相关基因表达检测:使用半定量(Ｒｕｎｘ２)、法测定成骨细胞相关基因成骨相关转录因子白(ＢＳＰ)和骨钙素锌指结构转录因子(ＯＣ)ꎮ的表达(Ｏｓｔｅｒｉｘ)、ꎮ细胞接种于培骨唾液酸蛋养瓶内ｍｍｏｌ/Ｌꎬ细胞贴壁后更换培养液并加入终浓度为β￣甘油磷酸钠和５０μｇ/ｍＬ抗坏血酸ꎬ同时１０分别加Ｌ)ꎬ入不同浓度的ＦＡＣ(０、５０、１００、２００μｍｏｌ/基对照组(０μｍｏｌ/Ｌ)加入不含ＦＡＣ的等量培养ＲＮＡꎮ细胞分为组细胞总ｇｅｎｔｓＴｏｔａｌ４组ꎬ每组３瓶ꎮ在培养４ｄ后用μｇＲＮＡ/μＬꎮ１μｇꎬ逆转ＲＮＡꎬＯｌｉｇｏ录提取后调整样本ＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ反(ｄＴ)应的１８体ＲＮＡ试剂盒提取各的浓度为１ｐｒｉｍｅｒ积为１２０μＬꎬ５μＬ:含×Ｒｅａｃｔｉｏｎ

模板总生工合成１ ２％琼脂糖凝胶ꎬ序列见表ꎬ１１０１ꎮＶ取电泳ＰＣＲ４０产物ｍｉｎꎬ６于紫外线箱

μＬ点样于凝胶成像系统进行扫描并照相记录ꎬ实验重复３次ꎬ并用ＩｍａｇｅＪ图像分析软件对目的基因和参数基因条带光密度值进行分析ꎮ

表１　ＧＡＰＤＨ和成骨细胞相关基因引物序列

及分子大小(ｂｐ)

Ｔａｂｌｅ１　ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＧＡＰＤＨａｎｄｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｒｅｌａｔｅｄ

ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｚｅ(ｂｐ)

基因引物序列

ｂｐＧＡＰＤＨ上游下游:５’￣４５２ｂｐＲｕｎｘ￣２上游:５’￣ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ￣３’下游:５’￣ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ￣３’ＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣＣＧＴＧＣＴＧ￣３’

２０８ｂｐＯｓｔｅｒｉｘ上游:５’￣下游:５’￣ＴＣＧＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＴＴＧＧ￣３’

ＡＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＧ￣３’２９７ｂｐＳｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ上游:５’￣ＡＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＴＡＣＣＡＣＧＡＧＣ￣３’下游:５’￣上游:５’￣ＴＣＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧ￣３’２８６ｂｐＯＣ

下游:５’￣ＣＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＧ￣３’:５’￣ＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧ￣３’

ＧＴＴＣＡＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧ￣３’

４２５ｂｐ

１ ２ ４　细胞碱性磷酸酶活性检测:６孔板中每孔接种１×１０５培养液并加入终浓度为/ｍＬ个ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１１０ｍｍｏｌ细胞/ꎮＬβ￣细胞贴壁后更换

５０μｇ/ｍＬ抗坏血酸ꎬ同时分别加入甘油磷酸钠和ＦＡＣ(０、５０、１００、２００μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ对照组(０不μｍｏｌ同浓/Ｌ)度加的

入不含ＦＡＣ的等量培养基ꎮ细胞分为４组ꎬ每组３瓶ꎮ继续培养至１０ｄ时ꎬ各孔加７５μＬ裂解液ꎬ收集上清ꎬ－７０℃冻存ꎮ用ＢＣＡ试剂盒测总蛋白浓度ꎬ用ＬａｂＡｓｓａｙＡＬＰ试剂盒测ＡＬＰ含量ꎮ用酶标仪选择５２０ｎｍ波长测定各孔吸光值(ＯＤ值)ꎬ根据测得ＯＤ值计算相对的ＡＬＰ活性ꎮ

１ ３　统计学处理

ＳＰＳＳ１９ 实验所得数据用均数±标准差表示ꎮ用

验组间比较采用０统计分析软件进行单因素方差分析Ｓｔｕｄｅｎｔ￣Ｎｅｗｍａｎ￣Ｋｅｕｌｓ(ＳＮＫ)ꎬ检验各实ꎬ

以Ｐ

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　２０１３年１０月第１９卷第１０期　ＣｈｉｎＪＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓꎬＯｃｔｏｂｅｒ２０１３ꎬＶｏｌ１９ꎬＮｏ.１０

２　结果

２ １　细胞增殖检测结果

ＭＴＴ结果提示ꎬＦＡＣ干预ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞２４ｈ

后ꎬＯＤ值随ＦＡＣ浓度增加而降低ꎬ各浓度组间比较有统计学差异(Ｐ

图１　不同浓度的对枸橼酸铁铵对ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１

细胞增殖的影响

Ｐ

Ｆｉｇ.１　(Ｅｆｆｅｃｔ各浓度组与对照组比较ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓꎬ∗ｏｆＦＡＣｏｎｔｈｅ

(∗Ｐｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

Ｎ＝５)２ 　

２　ＧＡＰＤＨ、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＢＳＰ细胞分化相关基因表达检测结果

电泳结果显示ꎬ各浓度组泳道条带和ＯＣＧＡＰＤＨ的扩增产物

亮度近似ꎬ各目的基因的亮度随ＦＡＣ干预浓度的增加逐渐减弱(图２)ꎬ与ＧＡＰＤＨ的光密度比值呈剂量依赖性降低(图３)ꎬ组间比较有统计学意义(Ｐ

ꎮ

图２　ＧＡＰＤＨ、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＢＳＰ和Ｆｉｇ.２　ＯＣＴｈｅ的扩增产物的琼脂凝胶电泳图

ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＧＡＰＤＨꎬ

２ 　

Ｒｕｎｘ２ꎬＯｓｔｅｒｉｘꎬＢＳＰꎬａｎｄＯＣｍＲＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ

３　碱性磷酸酶活性检测结果

本研究结果提示ꎬＦＡＣ干预ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细

胞

图３　不同组ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞相关基因电泳条带光密度值分析

Ｆｉｇ.(与对照组比较３　Ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙꎬ∗Ｐ、＃Ｐ、＾Ｐ、ａｎａｌｙｓｉｓ＄Ｐｏｆ

０.０５ꎬＮ＝３)

ｂａｎｄｓｏｆｃｅｌｌｓｒｅｌａｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｅｓｉｎｇｒｏｕｐｓ

ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１

　

(∗Ｐ、＃Ｐ、＾Ｐ、＄Ｐ

１０ｄ后ꎬ碱性磷酸酶活性指标随照组比较有ＦＡＣ统计浓度增加而降０ 低０５)(ꎬ各浓图度４)ꎮ

组与对学差异(Ｐ

图４　ＦＡＣ对ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞ＡＬＰ活性的影响Ｆｉｇ.(４　各浓度组与对照组比较Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓꎬ∗Ｐ

ｏｆＦＡＣ

　

(∗ｏｎＰ

Ｎ＝３)３　讨论

近年来多项研究表明ꎬ铁过载可导致骨质疏松ꎮ在动物实验中发现ꎬ铁过载可使动物骨密度降低ꎬ骨形成指标降低ꎬ骨吸收指标升高[４ꎬ５]外实验也证明ꎬ高铁环境可抑制成骨细胞活性ꎻ同时我们的体

ꎬ促进破骨细胞分化[６ꎬ７]骨细胞以及骨形成ꎮ、所以骨吸收均有显著影响ꎬ高铁环境对成骨细胞ꎮ在骨代、破谢过程中ꎬ成骨细胞的分化是一个复杂的过程ꎬ对于成骨细胞功能的发挥有着重要的意义ꎮ本实验研究高铁环境对成骨细胞分化的影响ꎬ有助于我们进一步了解铁过载对骨代谢的影响ꎮ

中国骨质疏松杂志　２０１３年１０月第１９卷第１０期　ＣｈｉｎＪＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓꎬＯｃｔｏｂｅｒ２０１３ꎬＶｏｌ１９ꎬＮｏ.１０

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小鼠颅盖骨细胞建株ꎬ在体外培养中具有成骨细胞的表型特征ꎬ可在抗坏血酸和β￣甘油磷酸的诱导作用下分化为成熟的成骨细胞ꎬ因而ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞成骨细胞的分化过程可分为几个阶段ꎬ包括增殖、细胞外基质沉积、基质成熟和矿化ꎮ为了研究成骨细胞的分化过程ꎬ本实验测定了不同分化阶段相关标志物的表达水平ꎬ包括Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＡＬＰ、ＢＳＰ和ＯＣꎮ其中ꎬＲｕｎｘ２和Ｏｓｔｅｒｉｘ在分化早期表达较高ꎬ可作为一个良好的研究成骨细胞分化的模型[８]ꎮ

ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞是一种前成骨细胞系ꎬ由新生引起细胞的氧化损伤[１４ꎬ１５]ꎮ

总之ꎬ本研究发现高铁环境可抑制前成骨样细

胞ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１的增殖和分化ꎮ本研究从成骨前体细胞增殖和分化的角度阐述了铁离子对成骨细胞的作用ꎬ补充了我们对铁过载影响骨代谢的认识ꎮ

【

参

考

文

献

】

[１]　ＬｉＧＦꎬＰａｎＹＺꎬＸｕＹＪꎬｅｔａｌ.Ｉｒｏｎｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ

ａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ.ＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓＩｎｔꎬ２０１２ꎬ２３(１０):２４０３￣２４０８.

[２]　ＸｕＹｏｕｊｉａꎬＬｉｎＨｕａ.Ｅｍｐｈａｓｉｓｏｎｔｈｅｒｏｌｅｏｆｉｒｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎ

ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｗｏｍｅｎｗｉｔｈｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ.Ｃｈｉｎｅｓｅ是成骨细胞分化的早期标志物ꎬ而ＡＬＰ和ＢＳＰ的表达在中期达到高峰ꎬ分化后期则是ＯＣ和细胞外基Ｒｕｎｘ２质钙化的出现又称核心结合因子ꎬＯＣ被认为是分化的晚期标志物[９]ａ１(Ｃｂｆａ１)ꎬ它的基因结ꎮ合位点位于ＢＳＰ、ＯＣ和ＣＯＬ１等基因的启动子ꎬ通过调节生长因子或细胞外基质的基因表达而参与成骨细胞分化及骨发育的全过程ꎬ因此Ｒｕｎｘ２被认为是成骨细胞分化的一个重要开关[１０]细胞分化过程中一个重要的成骨细胞特异性转录因ꎻＯｓｔｅｒｉｘ是成骨子ꎬ是ꎻＡＬＰＲｕｎｘ２是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白的直接靶标ꎬ促进成骨相关基因的表达[１１]性高ꎬ通过水解有机磷酸盐而增加局部磷酸盐的浓ꎬ特异度ꎬ从而导致该处形成羟磷灰石结晶ꎬ是鉴定成骨细胞的生化和组织学标志ꎬ并可用来评价骨发生[１２]ＯＣ是骨细胞外基质特异性蛋白由成骨细胞合成ꎬ与细胞外基质钙化高度相关ꎻ供体来提供细胞生长的高铁环境ꎮ在本实验中ꎬ我们运用ꎬ成骨细胞的鉴定标ꎬ志[１３]ＦＡＣꎬ结果发现作为铁离子的ꎬＦＡＣ对于ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞的增殖具有明显的抑制作用ꎻ我们在细胞培养４ｄ时即ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞分化的早期测定了Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＢＳＰ和ＯＣ基因的表达ꎬ结果发现ꎬ上述基因均有表达ꎬ其中Ｒｕｎｘ２和Ｏｓｔｅｒｉｘ的表达相对较高ꎬＢＳＰ次之ꎬ而ＯＣ的表达相对最低ꎬ符合成骨细胞早期分化的特点ꎮ进一步用ＦＡＣ干预后发现ꎬ上述基因的表达均受抑制ꎻ我们细胞培养１０ｄꎬ即ＡＬＰ分泌高峰时测定了ＡＬＰ的活性ꎬ结果发现ＦＡＣ对ＡＬＰ的活性同样具有明显的抑制作用ꎮ因此ꎬ我们认为高铁环境可抑制ＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１细胞的分化ꎮ对于铁离子抑制成骨细胞增殖和分化的机制ꎬ一般认为与氧化应激有关ꎮ高浓度的铁离子可通过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生活性较高的羟基氧自由基ꎬ从而促进活性氧水平的升高ꎬ而后者可通过激活许多信(ＭＡＰＫｓ)、号转热休克因子导途径如促(ＨＳＦ)分裂和核因子原活化(蛋ＮＦ￣Ｋｂ)白激酶等[３]　ＭｅｄｉｃａｌＸｕｆｏｒＹｏｕｊｉａꎬＸｉＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１１ꎬ９３(３１):２２２３￣２２２５.(ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ)

ＣｈｉｎｅｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎＨｕａｎｇ.ａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｉｒｏｎｏｖｅｒｌｏａｄ:ａｎｅｗｐｒｏｇｒａｍ

[４]　２０１２ꎬＫｕｄｏｏｖｅｒｌｏａｄＨꎬ５:１￣６.ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓａｎｄｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌＢｏｎｅＭｉｎｅｒａｌｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ.ＲｅｓｅａｒｃｈꎬｏｎＳｕｚｕｋｉ(ｉｎｒｅｎａｌＳꎬＣｈｉｎｅｓｅ)

ａｎｄＷａｔａｎａｂｅｈｅｐａｔｉｃＡꎬｓｉｄｅｒｏｓｉｓｅｔａｌ.ａｎｄＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｌｌｏｉｄａｌｉｒｏｎ

[５]　ｒａｔｓ.ＴｓａｙｏｖｅｒｌｏａｄＪꎬＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙꎬＹａｎｇＺꎬ２００８ꎬ２４６(２￣３):１４３￣１４７.

ｔｈｅｆｅｍｕｒｉｎｍａｌｅＲｏｓｓＦＰꎬｅｔａｌ.Ｂｏｎｅｌｏｓｓｃａｕｓｅｄｂｙｉｒｏｎ

[６]　ＢｌｏｏｄꎬＧｕｏ￣ｙａｎｇ２０１０ꎬ１１６(１４)ｉｎａｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌ::２５８２￣２５８９.

ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ.ｏｆＺｈａｏꎬＬｉ￣ｐｉｎｇＺｈａｏꎬＹｉｎ￣ｆｅｎｇＨｅꎬｅｔａｌ.Ａｉｒｏｎｔｈｅｅｘｃｅｓｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｒｏｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ.ｏｆｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｈＦＯＢ１ Ｔｒａｃｅ１９ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ

ｂｅｔｗｅｅｎ[７]　ＲｅｓｅａｒｃｈꎬＪｉａｏｓｔｅｏｃｌａｓｔＰꎬＸｕ２０１２ꎬ１４９(３):ＹＪꎬＺｈａｎｇＺＬꎬ４８７￣４９５.

Ｅｌｅｍｅｎｔｅｔａｌ.Ｆｅｒｒｉｃｉｏｎｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ.ｂｏｎｅＪｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎＯｒｔｈｏｐＲｅｓꎬｔｈｒｏｕｇｈｆａｃｉｌｉｔａｔｅ

２０１２ꎬｔｈｅ３０[８]　(１１):Ｏｗｅｎ１８４３￣１８５２.

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＴＡꎬｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆＡｒｏｎｏｗｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔＭꎬｏｓｔｅｏｂｌａｓｔＳｈａｌｈｏｕｂＶꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ

ｏｆｇｅｎｅｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｖｉｔｒｏ:ｗｉｔｈｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ[９]　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡｕｂｉｎＪＥ.Ａｄｖａｎｃｅｓｍａｔｒｉｘ.ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＪｄｕｒｉｎｇｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｔｈｅｂｏｎｅｉｎＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬ１９９０ꎬ１４３(３):４２０￣４３０.

[１０]　ＢｉｏｌꎬＫｏｍｏｒ１９９８ꎬ７６(６):８９９ｔｈｅ–９１０.

ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｌｉｎｅａｇｅ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｃｅｌｌ

[１１]　ｏｆＳｕｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＩＴ.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｋｅｌｅｔａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｔｈｅＲｕｎｘｆａｍｉｌｙ

ｉｎｖｏｌｖｅｄＤｏｎｇｍｅｉꎬｆａｃｔｏｒｓ.ｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｇＬｉｕＺｈｏｎｇｂｏꎬＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ２００５ꎬＯｓｔｅｒｉｘＺｈａｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒＹａｎꎬ９５(３):４４５￣４５３.

ａｃｔｉｖｉｔｙｅｔａｌ.ａｎｄＲｕｎｘ２ｇｅｎｅｉｓ

[１２]　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.Ｙｉｎ￣ｆｅｎｇｏｓｔｅｏｂｌａｓｔＨｅꎬＰｒｏｇｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＹｏｎｇＢｉｏｃｈｅｍＭａꎬＢｉｏｐｈｙｓꎬ２００６ꎬ３３(１０):９５７￣９６４.

ａｃｔｉｖｉｔｙＣｈａｏｔｈｒｏｕｇｈＧａｏꎬｅｔｏｘｉｄａｔｉｖｅａｌ.Ｉｒｏｎｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｈｉｂｉｔｓ

[１３]　ＴｒａｃｅＹｏｓｈｉｄａＥｌｅｍｅｎｔｂｅｔａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ｉｎｔｅｒａｃｔｓＣＡꎬＦｕｒｕｉｃｈｉＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１３ꎬ１５２(２):２９２￣２９６.

ｓｔｒｅｓｓ.ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＮａｔｗｉｔｈＧｅｎｅｔＲｕｎｘ２ＴꎬＦｕｊｉｔａ(Ｓ１０６１￣ａｎｄＴꎬｅｔａｌ.Ｃｏｒｅ￣ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ

４０３６)ꎬｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ２００２ꎬ３２ｆｏｒ(４):６３３￣ｓｋｅｌｅｔａｌ[１４]　６３８.

Ｙｅｏｎ￣ＳｏｏｋＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＬｅｅꎬＸｉａｏｗｅｉＣｈｅｎꎬＪｏｈｎＪ.Ｂ.Ａｎｄｅｒｓｏｎ.

ａｎｄＭＣ３Ｔ３￣Ｅ１ｐｒｏｔｅｃｔｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ￣ｌｉｋｅａｇａｉｎｓｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｒｅｅｃｅｌｌｓ.ｒａｄｉｃａｌ￣ｉｎｄｕｃｅｄｏｆｇｅｎｉｓｔｅｉｎｓｔｉｍｕｌａｔｅＮｕｔｒｉｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈꎬｏｘｉｄａｔｉｖｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ２００１ꎬｄａｍａｇｅ２１:ｏｆ[１５]　１２８７￣１２９８.

Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅｓｔｒｅｓｓ:１９２(１):１￣１５.

ｓｉｇｎａｌｉｎｇＪＬꎬＨｏｌｂｒｏｏｋｆｏｒｓｕｉｃｉｄｅＮＪ.ａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ.ＣｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅ

２００２ꎬ(收稿日期:２０１３￣０３￣２５ꎻ修回日期:２０１３￣０５￣１８)