碧云天谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒

谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 产品编号

S0056 产品名称 包装 谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒次

产品简介：

¾ 谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(Cellular Glutathione Peroxidase Assay Kit)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组

织或其它样品中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)活性的试剂盒。绝大部分细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶都是含硒的，且硒为该酶的活性中性组成部分。细胞内也有很少量的不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶存在。本试剂盒检测的是最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。

本试剂盒如果和总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(S0058)配合使用，可以定量检测出样品中不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。

谷胱甘肽过氧化物酶可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。细胞内的脂类容易和自由基发生反应，产生脂类过氧化物。谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)还原脂类过氧化物，从而消除自由基的毒害作用。

谷胱甘肽过氧化物酶几乎在所有组织中都有分布。在一些病理状况下谷胱甘肽过氧化物酶的活力会发生明显上调或下调。

谷胱甘肽过氧化物酶可以利用还原型谷胱甘肽(GSH)催化过氧化氢以及许多有机过氧化物，产生水或有机醇。如果以过氧化氢为底物进行检测，则同样可以分解过氧化氢的过氧化氢酶(Catalase)的酶活性会干扰谷胱甘肽过氧化物酶的测定。本试剂盒利用了一种间接测定的方法。谷胱甘肽过氧化物酶可以催化GSH产生GSSG，而谷胱甘肽还原酶可以利用NADPH催化GSSG产生GSH，通过检测NADPH的减少量就可以计算出谷胱甘肽过氧化物酶的活力水平。在上述反应中，谷胱甘肽过氧化物酶是整个反应体系的限速步骤，因此NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。

本试剂盒利用了如下的反应原理，GPx为谷胱甘肽过氧化物酶，GR为谷胱甘肽还原酶，R-OOH为过氧化物。 ¾ ¾ ¾ ¾ ¾

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¾ 本试剂盒提供的有机过氧化物试剂(t-Bu-OOH)在没有谷胱甘肽过氧化物酶存在的情况下不会和GSH产生反应，也不会被细胞内的过氧化氢酶催化而分解。因而可以较为特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。 由于t-Bu-OOH不能被不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶所催化，所以本试剂盒可以比较特异地定量检测最常见的含硒的谷胱甘肽过氧化物酶。 可检测组织匀浆产物、细胞裂解产物等样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。 包装清单：

产品编号

S0056-1

S0056-2

S0056-3

S0056-4

S0056-5

S0056-6

— 产品名称 包装 样品匀浆液谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液 50ml 谷胱甘肽还原酶

NADPH 5mg 还原型谷胱甘肽过氧化物试剂(t-Bu-OOH) 200µl 说明书份

保存条件：

谷胱甘肽还原酶4℃保存，其余-20℃保存，半年有效。NADPH溶解后宜-70℃保存，4℃可以保存一天，-20℃保存一周后NADPH会减少10%以上。GSH在配制成溶液后，适当分装，-20℃保存。

注意事项：

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¾ 本试剂盒检测时牵涉到氧化还原反应，所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。如果在样品中的还原剂无法避免，例如DTT、巯基乙醇等，则这些还原剂的总浓度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。 常用的Triton X-100、Tween 20等去垢剂都含有较高水平的过氧化物，会影响本试剂盒的测定。如果必须使用这些去垢

剂，最好使用纯度较高并注明含较低过氧化物的去垢剂。

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¾ 为消除样品中可能含有的可以消耗NADPH的酶的干扰，可以检测不加过氧化物试剂的样品作为对照。 样品可以立即测定，也可以-70℃冻存待以后测定。 一定要严格控制反应时的温度，否则会引起较多误差。 NADPH不太稳定，要严格按照后续说明操作，谨防失活。 谷胱甘肽还原酶配制在接近饱和的硫酸铵溶液中，存放一段时间后容易出现硫酸铵结晶，属正常现象。室温孵育促进晶体溶解后可继续使用。如果有水分蒸发到管壁上，则需先离心，随后再促进晶体溶解。如果出现盖子未盖紧导致水汽泄漏的情况，则需补加蒸发掉的水量，然后再促进晶体溶解。可在晶体溶解后使用，但不溶解晶体直接使用也可以，此时可以使用的酶的总体积会稍稍减小一些。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

1. 样品的准备：

a. 细胞样品的准备：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用EDTA处理细胞或

用细胞刮子收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤一遍。后续a1和a2步骤可以任选其一(优先推荐步骤a1)：

a1. 可以用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应说明裂解细胞样品。按照每100万细胞加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。如果出现裂解效果不佳的情况，可以把处在裂解液中的细胞样品用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。

a2. 可以用本试剂盒中的匀浆液，按照每100万细胞加入100-200微升匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。进行匀浆处理。

b. 组织样品的准备：动物用含有0.16mg/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后获

取组织样品。按照约每20mg组织加入200微升匀浆液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。

c. 红细胞裂解液的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500微升全血4℃ 2500g离心5分钟。弃上清，用冰冷的

约红细胞沉淀10倍体积的匀浆液重悬沉淀，再同前离心，弃上清。加入约红细胞沉淀4倍体积的冰冷的Milli-Q级纯水裂解红细胞。12000g离心5分钟，取上清。

d. 上述各种样品可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓

度。通常可以先取含20-100微克蛋白的样品用于检测。如果发现样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活力过高，可以用谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液进行稀释。如果样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活力过低，则需适当加大蛋白用量。准备好的样品如果当日测定，可以在冰浴保存，如果日后测定可以-70℃冻存。

2. 试剂盒的准备工作：

a. 配制10mM NADPH。取2.5mg NADPH，加入300微升Milli-Q级纯水或重蒸水，溶解，混匀。预计多余的NADPH需立即分装，-70℃保存。

b. 84mM GSH溶液的配制。在14mg GSH中加入550微升 Milli-Q级纯水，溶解并混匀。或称取少量GSH，配制少量84mM GSH溶液。预计多余的GSH需立即分装，-20℃保存。

c. GPx检测工作液的配制。根据待测定的样品数(含对照)，参考下表配制适当量的GPx检测工作液。配制好的GPx检测工作液仅限当日使用，且需尽量在冰浴上存放。

可测定样品数(含对照) 1个样品 10个样品 20个样品

10mM NADPH

84mM GSH 5 µl 5 µl 50 µl 50 µl 100 µl 100 µl

谷胱甘肽还原酶 0.4 µl 4 µl 8µl

GPx检测工作液体积 10.4 µl 104 µl 208µl

d. 15mM过氧化物试剂溶液的配制。取21.5微升过氧化物试剂(t-Bu-OOH)加入10毫升Milli-Q级纯水，混匀，即配制成15mM过氧化物试剂溶液。配制好的15mM过氧化物试剂溶液仅限当日使用，且需尽量在冰浴上存放。

e. 所有试剂使用前须在水浴中或PCR仪等设备上温育到25℃。

3. 样品测定： 表1

空白对照 (blank) 样品本底对照 样品 (sample)

谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液 186 µl 180-188 µl 176-184 µl

待测样品 － 2-10 µl 2-10 µl

GPx检测工作液 10 µl 10 µl 10 µl

15mM过氧化物试剂溶液 4 µl － 4 µl

总体积 200 µl 200 µl 200 µl

a. 参考表1，依次加入检测缓冲液、待测样品和GPx检测工作液，混匀。加入4微升15mM过氧化物试剂溶液后，反应开始。需适当混匀，可以使用培养板振荡器。

b. 使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A340。如果仪器可以设置温度，把温度设置在25℃，否则可以通过空调调节室温到25℃，待预计仪器也达到25℃后再开始测定A340。

c. 连续测定3分钟或自动每隔30秒测定一次A340。如果仪器不具备相应功能，可以手工操作，每隔30秒记录A340值，至少连续记录3分钟，获得6个点的数据。前15秒的数据由于反应体系需要混合等原因，数据可能不太准确，需弃掉。

d. 第一次测定时建议做1-2个样品本底对照，如果样品本底对照和空白对照非常接近，则说明样品中不存在干扰物质，后续检测类似样品时，可以不再检测样品本底对照。如果样品本底对照和空白对照有显著差异，则每个样品在测定时多需做样品本底对照。计算时每个样品的A340/min都需要扣除相应的样品本底对照测定出来的A340/min。

e. 测定出来的A340/min最好能控制在0.03-0.15范围内。如测定出来的A340/min数值过大，则可以把样品适当稀释，如A340/min数值过小，处理样品时需设法尽量浓缩样品。

4. 样品中谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的计算：

a. 谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1 unit)在25℃，pH8.0，在GSH、谷胱甘肽还原酶、t-Bu-OOH存在的条件下，在1分钟内可以催化1微摩尔NADPH转变成NADP+。1 U=1000 mU。

b. 对于谷胱甘肽过氧化物酶溶液：1mU/ml＝1nmol NADPH/min/ml＝(A340/min)/0.00622

即相当于：[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]=[A340/min(sapmle)－A340/min(blank)]/0.00622

注：[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为mU/ml。

c. [样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]＝[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力] X[稀释倍数]/[样品中的蛋白浓度]

[样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；

[样品中的蛋白浓度]的单位为：mg/ml。

d. 计算示例：样品的蛋白浓度经测定为0.5mg/ml，用样品稀释液稀释2倍后，取10微升稀释后的样品参考表1进行测定。如果A340/min(sapmle)＝0.065，A340/min(blank)＝0.003，那么

[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]= (0.065-0.003)/0.00622=10mU/ml

[样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]= 10mU/mlX2X20/(0.5mg/ml)=800mU/mg(蛋白)

使用本产品的文献：

1. Pan Q, Huang K, He K, Lu F.

Effect of different selenium sources and levels on porcine circovirus type 2 replication in vitro.

J Trace Elem Med Biol. 2008;22(2):143-8.

2. An R, Dong C, Lei Y, Han L, Li P, Chen J, Wang G, Shi Q, Gao C, Jiang H, Zhou W, Han J, Chu Y, Dong X.

PrP mutants with different numbers of octarepeat sequences are more susceptible to the oxidative stress.

Sci China C Life Sci. 2008 Jul;51(7):630-9. Epub 2008 Jul 13.

3. Wang XZ, Liu SS, Sun Y, Wu JY, Zhou YL, Zhang JH.

Beta-cypermethrin impairs reproductive function in male mice by inducing oxidative stress.

Theriogenology. 2009 Sep 15;72(5):599-611.

本说明书最后修订于2010.3.7