小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
论 著
2012年1月
1319-1320.
[2]董天华.成人股骨头缺血性坏死的现代新概念[J].苏州医学院报, 2000, 20(12): 1078-1080.
[3]陈志刚.关节病影像诊断学[M].西安:陕西科技出版社, 1999.346-348.
[4]高元桂,蔡幼铨,蔡祖龙,等.磁共振成像诊断学[M].北京:人民军医出版社, 1997. 683-684.
[5]Guerra JJ,Steinberg ME.Distinguishing transient osteoporosis from avascular necrosis of the hip.J Bone Joint Surg(Am),1995,77(4):616-624.
[6]Mitchell DG, Rao VM, Dalinka MK, et al Femoral head avascular necrosis; correlatlon of MR imaging, radiolographic staging, radionuclide imaging and clinical finding[J].Radiology 1997, 162(11): 708-709.
[7]Doury P. Bonemarrow edema, transient osteoporosis and algodystrophy[J].J Bone Joint Surg(Br), 1994, 76(12): 993-997.
于X线平片的30.6%。目前,CT已成为诊断早期股骨头缺血坏死常规检查手段。但CT无法显示早期的骨髓坏死、肉芽组织浸润,因此CT诊断早期FHN也有一定限度。MRI软组织分辨率比CT高,图像层次丰富,可取得任意方位多参数成像,定性、定位诊断比CT更准确,不但能显示解剖形态变化,而且还可提供病理及生化方面信息,因此可更有效显示股骨头坏死早期病变。本组MRI诊断早期FHN的阳性率是100%。结果表明,X线平片、CT及MRI在诊断早期FHN方面,以MRI最具敏感性和特异性,是诊断早期FHN的金准,CT次之,而X线平片诊断价值明显受限,但X线平片具有操作简便、费用低,在显示骨全貌、骨性关节面及髋关节间隙等方面要优于CT和MRI,可用于FHN的筛选和随访。总之,当临床有症状X线平片有或无改变的患者应常规CT检查,多数早期病变可被发现。对于CT仍不能诊断的患者应行MRI检查,以便尽早发现病变,及时给予治疗,减少致残率。参考文献
[1]周康荣,陈祖望.体部磁共振成像[M].上海:上海医科大学出版社, 2000.
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3
(1福建医科大学省立医院临床学院血液科 福建福州 350001)
(2福建省立医院检验科 福建福州 350001)(3福州大学生物工程学院 福建福州 350001)
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起源于中胚层,具有高度增殖和自我更新的能力,有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1],可分化成骨髓基质支持造血,并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化,同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞,在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节,预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2],但骨髓间充质干细胞含量极低,仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3],因此,培养出生长状态良好,足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性,C57BL/6小鼠,清洁级,8周龄,体重18-20g,购于吴氏动物实验中心。
1.1.2 实验仪器与试剂 低糖DMEM培养基(Gibco公司),特级胎牛血清(Hyclone公司),胰蛋白酶(Sigma公司),青霉素钠(Sigma公司),链霉素(Sigma公司),5%CO2培养箱(日本三洋公司),流式细胞仪(BD FA CSCalibur),倒置显微镜(OLYMPUS),大鼠抗小鼠单克隆抗体:CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC(BD公司)。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠,颈椎脱臼法处死,75%酒精浸泡5分钟,取出双侧腿骨,置于装有PBS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织,移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L的低糖DMEM培养液的培养皿中,剪去腿骨两端,用1ml注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔,直至骨发白,收集冲洗液,反复吹打使细胞打散,静置10分钟,小心将上
清移至灭菌的10ml离心管中,4℃3000rpm离心3分钟,弃上清,用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞,反复吹打混匀,4℃3000rpm离心3分钟,弃上清,再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞,反复吹打混匀,4℃3000rpm离心3分钟,弃上清,再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞,反复吹打混匀,调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中,置于5%C02,37℃,饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后,轻轻吸出上清,并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打,使未贴壁的细胞悬浮,吸出上清,加入新鲜的培养液,继续培养。以后每天换液1次,并观察细胞形态。
1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养 原代细胞生长接近瓶底的80%时,吸去上清,加入0.125%胰蛋白酶,37℃条件下消化并观察细胞形态,待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶,加入新鲜培养液重悬细胞,4℃3000rpm离心3分钟,弃上清,再加入培养液重悬细胞,反复吹打混匀,按1:2比例接种到新的培养瓶,置于5%C02,37℃,饱和湿度95%的培养箱中继续培养,仍然每天换液,直至细胞贴壁融合成片,接近瓶底80%时,重复以上操作,再次传代。
1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定 收获第4代及第8代生长良好的细胞,胰酶消化后,4℃1000rpm离心5分钟,弃上清,PBS洗涤细胞2次,每代细胞分别设2管,调节每管细胞数为5×105,分别加入CD29和CD44、CD34和CD45单抗,室温孵育30分钟,PBS洗涤细胞3次,流式细胞仪检测分析,同时用PBS作为一抗设置阴性对照。2 结果
2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增 培养4小时后吸出上清,加入新鲜培养液后,大多数悬浮细胞被吸出,瓶中细胞数目明显减少,
82 医药前沿
万方数据
并且都呈现球转,折光率较强,原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时,细胞开始贴壁,胞体呈圆形或多边形,培养第3-5天,细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形,并不断长大、变长,但未观察到细胞分裂,培养第7天开始观察到细胞分裂(图1),随着细胞数的增加,细胞的生长速度变快,逐渐成漩涡状排列,培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%,并融合成片(图2)。传代后细胞生长迅速,培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
Figure 1 Primary culture
of murine bone marrow-derivedmesenchymal stem cells at 7 days after culture (×100)
图 1 小鼠骨髓间充质干细胞原代培养第7 天(×100)
Figure 2 Primary culture of murine bone marrow-derived mesenchymal stem cells at 12 days after culture (×100)
图 2 小鼠骨髓间充质干细胞原代培养第12 天(×100)
2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定 流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45(图3、4),但表达CD29、CD44,纯度
分别为73.8% 、91.65%(图5、6)。
图 3 小鼠骨髓间充质干细胞培养
第4代
图 4 小鼠骨髓间充质干细胞培养第8代
图 5 小鼠骨髓间充质干细胞培养第4代
B1 (CD29) 188 B2 (CD29+CD44) 4952 B3 (Negative) 616 B4 (CD44) 1580
万方数据
2012年1月
论 著
图 6 小鼠骨髓间充质干细胞培养第8代
B1(CD29) 302B2 (CD29+CD44+) 7382B3 (Negative) 142B4 (CD44) 329
3 讨论
间充质干细胞主要来源于骨髓,可分化为骨髓基质细胞,分泌多种基质分子(如纤维粘连蛋白、胶原蛋白、蛋白聚糖等),还可分泌多种造血生长因子、趋化因子,抑制T淋巴细胞增殖,具有支持造血,促进造血干细胞移植后造血功能恢复、预防和减轻移植后的移植物抗宿主病的潜能[2,4],实验研究表明,MSCs在促进植入和免疫抑制效应的强度与剂量有关[5]但MSCs在体内含量极少,因此,对其进行分离、纯化和扩增显得极为重要。
目前,MSCs的分离技术和方法主要有贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法、免疫磁珠法。应用流式细胞仪分离和免疫磁珠法可以得到纯度较高的细胞,但对细胞的活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性,且方法复杂;使用percoll分离液进行密度梯度离心,能有效将间充质干细胞分离出来,但常导致分离得到的单个核细胞数量较少,不利于接种后细胞的生长。贴壁法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法,至今仍是一种得到广泛应用的经典途径[6,7]。本实验采用贴壁培养法,直到培养第7天开始观察到细胞分裂,与文献报道[7,8]第3-5天即可出现明显分裂增殖相比所需时间长,可能与培养4小时后吸出上清,瓶中细胞数目明显减少有关,随着细胞数的增加,细胞的生长速度变快,逐渐成漩涡状排列,再次证实接种培养时要注意保持培养瓶内有一定的细胞密度,密度太低,不利于细胞生长。培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%,并融合成片。传代后细胞生长迅速,培养7天左右即可长满瓶底的80%。与文献报道所需时间相仿[7,8],传至10代仍具有良好的增殖活性。提示本研究采用的培养基、早期换液及此后的每天换液培养方式可以满足体外培养下MSCs快速生长的要求,为进一步实验提供足够数量的MSCs。研究表明骨髓MSCs不表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、碱性磷酸酶或骨桥蛋白等与分化相关的标志,也不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR等造血干细胞的表面标志,但表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD106、CD90等。因此,BMSCs表面标志物具有非单一性的特性,目前对BMSCs主要是通过其形态学特征和多种表面标志相结合来进行鉴定[9]本实验应用流式细胞仪对培养的第4代、第8代细胞的CD34、CD45、CD29、CD44等4个表面抗原进行了鉴定,均不表达CD34、CD45,但表达CD29、CD44,纯度分别为73.8% 、91.65%,提示随着传代的增加,细胞纯度增加,达90%以上,可以满足进一步实验要求。
综上所述,采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞,随传代数增加,其纯度增加,且该方法简单、实用。参考文献
[1]Quirici N ,Sologo D, Bossalasco P,et al.Isolation of bone marrow cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies[J].Exp Hematol, 2005,30:783-791.
[2]宋一雪,王军,陈虎。间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用[J],现代生物医学进展,2009,9(5)986-1000.
[3]王佳南,张晓刚,汤为学等,大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件[J],中国组织工程研究与临床康复,2009,13(14):2740-2745.
[4]金建刚,冯凯,石炳毅等,MSCs诱导移植物免疫耐受的研究进展[J]。临床血液学杂志,2009,22(58-60).
[5]MaitraB, Szekely E, Ggini K, etal.Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation[J] Bone Marrow Transplant,2004,3(6):597-604.
[6]裴瑛波,骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状[J],中国组织工程研究与临床康复, 2009,13(14):2775-2778.
[7]宫晓洁,孙莉、黎靖宇,小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及形态学观察[J],解剖学研究,2008,30(1)54-56.
[8]王刚,吕同德,马静等,大鼠骨髓MSCs表面分子检测及诱导分化研究[J],中国实验诊断学,2008,12(1)12-15.
[9]倪玉霞,李澎,李贻奎,大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定[J],广西医科大学学报,2009,26(1)10-13.
医药前沿 83
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
作者:作者单位:
林芸, 蔡鹏威, 陈为民, 孟春, Lin Yun, Cai Peng Wei, Chen Wei Min, Meng Chun
林芸,陈为民,Lin Yun,Chen Wei Min(福建医科大学省立医院临床学院血液科,福建福州,350001), 蔡鹏威,CaiPeng Wei(福建省立医院检验科,福建福州,350001), 孟春,Meng Chun(福州大学生物工程学院,福建福州,350001)医药前沿
YIAYAO QIANYAN2012,02(1)
刊名:英文刊名:年,卷(期):
1.Quirici N;Sologo D;Bossalasco P Isolation of bone marrow cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies 20052.宋一雪;王军;陈虎 间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用[期刊论文]-现代生物医学进展 2009(05)
3.王佳南;张晓刚;汤为学 大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件[期刊论文]-中国组织工程研究与临床康复 2009(14)4.金建刚;冯凯;石炳毅 MSCs诱导移植物免疫耐受的研究进展 2009
5.MaitraB;Szekely E;Ggini K Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation 2004(06)
6.裴瑛波 骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状[期刊论文]-中国组织工程研究与临床康复 2009(14)7.宫晓洁;孙莉;黎靖宇 小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及形态学观察[期刊论文]-解剖学研究 2008(01)8.王刚;吕同德;马静 大鼠骨髓MSCs表面分子检测及诱导分化研究[期刊论文]-中国实验诊断学 2008(01)9.倪玉霞;李澎;李贻奎 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定[期刊论文]-广西医科大学学报 2009(01)
引用本文格式:林芸.蔡鹏威.陈为民.孟春.Lin Yun.Cai Peng Wei.Chen Wei Min.Meng Chun 小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定[期刊论文]-医药前沿 2012(1)