几株教学用放线菌的分离和鉴定
2010中山大学研究生学刊(自然科学、医学版)第31卷第4期JOURNAL OF THE GRADUATES VOL. 31ɴ4 SUN YAT-SEN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCES 、MEDICINE )2010
几株教学用放线菌的分离和鉴定
范新炯
(中山大学生命科学学院,广州510275)*
【内容提要】为得到教学上使用的螺旋型孢子丝的放线菌,采集土样,从中筛选出几株放线菌,在高氏Ⅰ号培养基上多次划线得到纯培养。按照阎逊初主编的《放线菌的分类和鉴定》手册对两株产螺旋型孢子丝的放线菌进行了传统分类。经过形态观察和生理生化试验初步鉴定两株菌分别为淡紫色灰链霉菌8006和绿产色链霉菌783。本研究得到的两株菌具有放线菌的典型特征,有明显的气生菌丝和孢子丝,而且孢子丝弯曲程度大,适合教学用。
【关键词】放线菌;鉴定;分类学
1
1. 1前言放线菌1
放线菌由于菌落呈放射状而得名。它均有生长发育良好的菌丝体,其直径为0. 2-
1. 2um 。革兰氏染色绝大多数为阳性,少数为阴性。放线菌是由哈尔兹(Harza )于1877年发现的,当时他所发现的一种厌气寄生的牛型放线菌,从那个时候起就引用了放线菌这个属名Actinomyce ,后来把腐生好气的这类菌也叫做放线菌。1948年瓦克斯曼(Waksman )把好气腐生的放线菌另立为链霉菌(Streptomyces ),而将厌气的寄生的仍叫放线菌属。我们这里所说的放线菌并不是指放线菌属而言,而是放线菌类总的称呼。
1. 2放线菌与人类的关系1
放线菌大部分是腐生菌,少数是寄生菌。腐生菌放线菌在自然界的物质循环中起着一定的作用。有的菌与植物共生,固定大气氮,如弗兰克氏菌属。有的产生抗生素,抗生素是用于医疗卫生的主要药物之一,据不完全统计,至目前为止由防线菌产生的抗菌素约1700种左右。另外放线菌还产生各种酶和维生素等,目前腐氏链霉菌等产生的蛋白酶已在皮革脱毛工业上应用。此外甾体转化、石油脱蜡、污水处理等方面也有所应用。寄生型放线菌能引起动物和植物的病害,除分支杆菌所引起的肺结核、麻风病外,
*收稿日期:2010-11-21
作者简介:范新炯,女,1985年生,中山大学生科院08级硕士研究生。主要研究方向为环境
mail :fanxinjiong@126. com 微生物与蛋白质组学。E-
放线菌所引起的动物病害主要是放线菌病和诺卡氏菌病。从上述事实看出,放线菌与人类的关系式非常密切的。
1. 3放线菌在自然界中的分布
放线菌在自然界中主要生存于陆地和淡水中,在大气中常有悬浮,海洋中则比较少见。尤其是土壤为这类微生物的主要习居场所,无论在种类和数量上都比其他地方繁多。土壤的性质、季节、植被等条件都影响土壤里生存的放线菌的种类和数量。一般说来,在中性或偏碱性的土壤和有机质等丰富的土壤中较多。放线菌以孢子和菌丝片段的形式存在于土壤,每克土壤内含有数万、数十万的孢子。
由于各类放线菌的形态和生理上的差异,不同属放线菌的生态分布也不尽会完全一样。如链霉菌属(Streptomyces )适宜在水量较低、通风较好的土壤中生长;游动放线菌属(Actinoplanes )、孢囊链霉菌(Streptosporangium )喜欢在潮湿的土壤或沟旁的残枝腐叶上生长;而在海洋内则可能有嗜盐的放线菌存在。
1. 4放线菌的生活史和形态特征
放线菌的孢子和孢囊孢子在适宜的环境下吸收水分,膨胀萌发,生出芽管1-3个,芽管伸长长出分枝,分枝越来越多,形态菌丝体。因其菌丝体在培养基内,即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔,由于菌丝体长入培养基内和培养基表面,并纠缠在一起形成密集的菌落,所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽,但也有无色。它产生的色素有溶于水的为水溶性色素;溶于有机溶剂的为脂溶色素。
由基内菌丝体向空间长出的菌丝体叫做气生菌丝体。在显微镜下观察时,气生菌丝体颜色较深,且较基内菌丝体粗两倍左右。
气生菌丝体发育到一定阶段,在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分,其螺旋的方向也有左旋与右旋之分,大多数种为左旋,少数为右旋。螺旋的数目也是种的特征之一。
孢子具有不同的形状,有球形、椭球形、杆状、柱状,在光学显微镜下就能看清。因为从一个孢子丝分化出而来的孢子可能有各种不同的形状,不能一概以孢子的大小和形状作为区分种的重要指标之一,还要结合孢子表面结构来加以区分。电镜下可看到孢子表面,有的光滑,有的有小疣,有的有刺。孢子的表面结构在鉴定种时很重要,是形态特征不可缺少的项目之一。
1. 5放线菌在微生物中的分类地位
由于放线菌形成分枝的菌丝体,有气生菌丝体和基内菌丝体之分,又形成孢子,再1加上在固体和液体培养基内的生长形状很像真菌。所以在19世纪末至20世纪初,人们常把它列入真菌。随着微生物分类学的研究,确认放线菌与细菌的关系比同真菌的关系更密切,后来才把它列入细菌。
1. 6放线菌分类的重要意义
放线菌分类与动植物分类一样,其目的是了解自然,认识自然,以便对它们进行利用和改造。放线菌分类是随着抗生素事业的兴起而大大发展起来的。为了提高抗菌素、维生素、酶及其它有用代谢产物的筛选工作效率并摆脱盲目性,必须对放线菌的分类鉴
定有一定的认识。
因此,无论是从益菌的利用还是有害菌的防治方面来看,都必须认识这类微生物。放线菌分类学主要是帮助我们达到这个目的。以形态和培养特征为主,生理生化特性和生态条件为辅的分类原则,至今仍为大多数分类工作者所遵循。近来,由于微生物生理生化的迅速发展,特别是分子生物学的渗透,为生物分类学出现由描述科学向实验科学转化的强烈趋势。
本研究通过合适的分离和筛选手段,从土壤中筛选出孢子丝螺旋明显、较适合教学用的两株放线菌,并通过形态和培养特征、生理生化特性初步鉴定出它们的类别。一菌株为淡紫灰链霉菌,一菌株为绿产色链霉菌。
2
2. 1放线菌的分离和筛选实验材料
试剂:
(1)20%甘油
(2)0. 1%美蓝
A 液:美蓝0. 3g ,95%乙醇300ml ;
B 液:0. 01%KOH 100ml
混合A 和B 液即成
2. 1. 1. 3革兰氏染液3
(1)结晶紫染色液:甲液结晶紫2g ,95%乙醇20ml ;
乙液草酸铵0. 8g ,蒸馏水80ml 。
甲乙液先分别溶解,然后混合在一起,过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。
(2)碘液:碘1g ,碘化钾2个,蒸馏水100ml 2. 1. 1
先取少量蒸馏水加入碘和碘化钾,使碘完全溶解后再加入全部蒸馏水,分装于滴瓶中备用。
(3)复红酒精溶液:碱性复红0. 4g ,95%乙醇100ml ,溶解装入滴瓶备用。
[3]2. 1. 2培养基
分离培养基:高氏Ⅰ号培养基(w /v)
可溶性淀粉2%,KNO 30. 1%,NaCL 0. 05%,K 2HP040. 05%,MgSO 40. 05%,FeSO 40. 001%,琼脂2%
2. 2
2. 2. 1
2. 2. 2实验方法采样放线菌的筛选
系列稀释[4]取药院后门口花园5-10cm 处土壤,放于采集袋中带回实验室。2. 2. 2. 1
在无菌纸上称取样品5个,放入三角瓶中,内含玻璃珠45ml 无菌水,涡旋振荡10min ,用1ml 无菌吸管吸取0. 5ml 注入4. 5ml 无菌水试管中,系列稀释至10-6。2
培养与挑菌
-4-5-6从稀释度为10,10,10的菌悬液中分别吸取0. 1ml 涂布在高氏Ⅰ号平板培养
基上,每个稀释度涂三个平板。28ħ 培养7d 。挑选出不同的单菌落,并在平板上进行三次划线,挑取单菌落,并通过镜检,确定为纯培养。
2. 2. 3菌种的保存
短期保存:将菌株划线于高氏Ⅰ号斜面上,并于4ħ 下保存。
长期保存:取一支斜面培养菌,加入7ml 20%无菌甘油,制成菌悬液,分装至无菌保种管中,每管1ml ,共六支保种管。
2. 3筛选结果
对采集的土样进行稀释分离,经过多次划线纯化,同时进行镜检观察,筛选出两株形态不同的放线菌08-1和08-2菌株。
在高氏Ⅰ号培养基上,08-1号菌株菌落正面颜色为灰紫色,反面颜色为白色;08-2号菌落正面颜色为蓝绿色,反面颜色为微黄色。菌落形态见图2-1和图2-2
。2. 2. 2. 2
图2-108-1菌落形态图2-208-2菌落形态
2. 4本章小结
土壤是微生物的大本营,微生物种类非常庞大,而从中分离筛选到某种微生物带有很大的随机性,因此分离源的选择和筛选手段等都很重要。高氏Ⅰ号培养基中营养成分和特定PH 、合适的培养条件,对于筛选、培养放线菌非常重要。平板划线是纯化微生物的主要方法,要的到纯种,三次以上划线的结果较理想。
3放线菌的传统鉴定
要确切地鉴定一株放线菌,在形态和生理方面要做很多试验。但这些试验在分类上
[3]有主次,并非同等重要。首先应根据形态特征,主要包括基内菌丝体的发育程度、是
否断裂有无气生菌丝体和孢子、孢子囊、菌核以及其它结构,还要说明孢子丝、孢子、孢子囊、孢囊孢子的形状、大小、数目等;各类繁殖小体是否有鞭毛能游动以及鞭毛的位置等。此外还要注意培养特征,基丝和气丝,特别是孢子的颜色很重要,例如许多种的种名:黄、橙、红、紫、蓝等都指的是基丝的颜色,最重要的是孢子成堆的颜色。不同的培养基产生不同的培养特征,国际链霉菌计划用四种培养基:甘油-天冬素琼脂、无机盐淀粉琼脂、酵母精麦芽精琼脂和燕麦粉琼脂,用以观察形态和培养特征。但时常这些培养基还是不够的,还必须加上蔗糖硝酸盐琼脂,用以观察形态和培养特征。但时常这些培养基还是不够的,还必须加上蔗糖硝酸盐琼脂、葡糖天冬素琼脂、营养琼脂、马铃薯块、高氏Ⅰ号琼脂等,才能充分看到某些菌的特点。
但只根据形态特征和培养特征还不够,要进一步区分属以下的种时主要依靠生理生化特点,测定几种酶活性如明胶液化、牛奶凝固和胨化、淀粉水解、纤维素分解或在其上生长、硝酸盐还原等几种生理实验。
3. 1
3. 1. 1实验材料试剂
(1)甲基红试剂
甲基红0. 04g ,95%乙醇60ml ,蒸馏水40ml
(2)格里斯氏(Griess )试剂5
A 液:对氨基苯磺酸0. 5g
10%稀醋酸150ml
B 液:α-萘胺0. 1g
蒸馏水20ml
10%稀醋酸150ml
(3)卢氏碘液
碘2g ,碘化钾3g ,蒸馏水100ml
(4)V -P 试剂
A 液:5%α-萘胺无水乙醇溶液
α-萘胺5g 无水乙醇100ml
B 液:40%KOH 溶液
KOH 40g 蒸馏水100ml
(5)石蕊液
石蕊2. 5g 蒸馏水100ml
3. 1. 2培养基
(1)蔗糖硝酸盐琼脂培养基(w /v)
蔗糖3%,NaNO 30. 2%,K 2HPO 40. 1%,MgSO 40. 05%,KCl 0. 05%,FeSO 40. 001%,琼脂1%-2%,pH 7. 0-7. 3
(2)葡糖天冬素琼脂培养基(w /v)
GLC 1%,天冬素0. 05%,K 2HPO 40. 05%,琼脂1. 5-2%,pH 7. 0-7. 3
(3)淀粉无机盐琼脂培养基(w /v)63
甲液:将10g 可溶性淀粉用少量蒸馏水调成糊状,再配成500ml 可溶性淀粉溶液。乙液:K 2HPO 40. 1%,MgSO 40. 1%,NaCl 0. 1%,(NH 4)2SO 40. 2%,CaCO 30. 2%,微量盐溶液1ml (含FeSO 40. 1g ,MnCl 20. 1g ,ZnSO 40. 1g ,蒸馏水100ml )
把甲液和乙液混合,加入琼脂1%-2%,pH 7. 0-7. 3
(4)营养琼脂培养基(w /v)
牛肉膏0. 1%,酵母膏0. 2%,蛋白胨0. 5%,NaCl 0. 5%,琼脂1. 5-2%,pH 7. 0-7. 3
(5)肉汤琼脂培养基(w /v)
牛肉膏1%,蛋白胨1%,NaCl 0. 5%,琼脂1. 5-2%,pH 7. 0-7. 3
(6)燕麦粉琼脂培养基(w /v)
燕麦粉6. 5%,琼脂1%-2%,pH 7. 0-7. 3
(7)甘油天冬素培养基(w /v)
甘油1%,天冬素0. 1%,微量盐溶液1ml (含FeSO 40. 1g ,MnCl 20. 1g ,ZnSO 40. 1g 蒸馏水(100ml )
(8)马铃薯块3
马铃薯削皮切块后,放入试管中灭菌。
(9)明胶液化培养基(w /v)
牛肉膏0. 05%,蛋白胨0. 1%,NaCl 0. 05%,明胶12%,pH 7. 0-7. 3
(10)Glc -蛋白胨水培养基(w /v)
蛋白胨0. 05%,K 2HPO 40. 02%,Glc 0. 05%,pH 7. 0-7. 3
(11)淀粉培养基(w /v)
蛋白胨1%,NaCl 0. 5%,牛肉膏0. 5%可溶性淀粉0. 2%,琼脂1. 5%,pH 7. 0-7. 3
(12)硝酸盐还原培养基(w /v)
蛋白胨1%,NaCl 0. 5%,KNO 30. 1%,pH 7. 0-7. 3
(13)石蕊牛奶
2. 5%石蕊水溶液4ml ,脱脂牛奶100ml
(14)H 2S 产生培养基(w /v)5
蛋白胨2%,NaCl 0. 5%,柠檬酸铁铵0. 05%,Na2S2O30. 05%,琼脂1%-2%,pH 7. 0-7. 3。
(15)纤维素分解实验培养基(w /v)5
蛋白胨0. 5%,NaCl 0. 5%,pH 7. 0-7. 3
(16)高氏Ⅰ号培养基(w /v)5
可溶性淀粉2%,KNO 31%,NaCl 0. 05%,K 2HPO 40. 05%,MgSO 40. 05%,FeSO 40. 001%,琼脂2%,pH 7. 0-7. 3
3. 2
3. 2. 1
实验方法菌落形态观察在以上各种培养基上划线,28ħ 培养5-30d ,观察、记录菌落特征。
孢子丝气生菌丝孢子的形态观察
在高氏Ⅰ号平板上扦片培养7d ,取出玻片在微生物下观察并照相;用印片法,玻片在菌落上轻轻按一下,0. 1%美蓝染色,在显微镜下观察并照相。
3. 2. 3. 1明胶液化试验3
在明胶试管培养基中,穿刺接种,室温培养5-15d ,观察有无明胶液化现象。
3. 2. 3. 2硝酸盐还原试验
将待测菌接种于硝酸盐液体培养基,室温培养1、3、5d ,每株做两个重复,另两管不接作对照。
取两支干净的空试管倒入少许培养1、3、5d 的培养液,再加一滴A 、B 液。
当培养液中滴入A 、B 液后,溶液如果变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在,为硝酸盐还原阳性。如果无红色出现,则可加一两滴二苯胺,如呈蓝色反应,表示无硝酸盐还原作用;如果不呈蓝色反应,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已经还原成其它物质,故仍应按硝酸盐还原阳性处理。
3. 2. 3. 3淀粉水解试验
在淀粉培养基上划线培养菌株,28ħ 培养5d 。滴加卢氏碘液,观察有无透明圈产生。
3. 2. 3. 4甲基红试验3
将一直GLC -蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴,培养基变为红色者为阳性,变为黄色者为阴性。
3. 2. 3. 5V -P 试验3
将另一支GLC -蛋白胨水培养基培养物内加入5-10滴40%KOH ,然后加入等量的5%α-萘酚溶液,用力震荡,再放入37ħ 恒温箱15min 。若培养物呈红色,为V -P 反应阳性。
3. 2. 3. 6
3. 2. 3. 7H 2S 产生试验3石蕊牛奶试验5穿刺培养72h 后观察,有无黑色硫化铅产生。
将待测菌菌接种于石蕊牛奶培养基,28ħ 培养。
1、3、5、7、14、30天观察酸碱反应、酸凝、酶凝胨化、还原等。
还原-石蕊褪色变白;胨化-牛奶变清;
产酸-石蕊变红;产碱-石蕊变蓝;
酸凝-变红和凝固;酶凝-不变色或蓝色,牛奶结块,凝固。
3. 2. 3. 8纤维素分解实验5
将培养基分装试管,在培养基中浸泡一条优质滤纸,纸条宽度以易于放入试管为宜,纸条长度约5-7cm 。28ħ 培养10-20d 。能将滤纸分解成一团纤维或将其折断变薄为阳性,无变化为阴性。
3. 3
3. 3. 1试验结果形态观察
3将筛选出来的两株菌08-1和08-2分别在检索表中按要求的各种培养基上划线,
培养观察菌落形态结果见图和图从图中可以观察出号菌株菌落正面颜色为灰紫色,反面为白色;08-2正面颜色为蓝绿色,反面为微黄色。形态见图2-1和图2-2
。
图3-108-1菌落的形态和颜色
图B :
菌落的反面形态和颜色图A :菌落的正面形态和颜色;
图3-208-2菌落的形态和颜色
图D :菌落的反面形态和颜色图C :菌落的正面形态和颜色;
3. 3. 2
孢子丝、气生菌丝和孢子形态在高氏Ⅰ号平板上扦片培养08-1和08-2菌株7d ,显微镜观察各菌株孢子丝形
态,同时采用印片法,观察各菌株的孢子形态。结果见图3-3,图3-4,图3-5和图3-6。从图中可看出,08-1菌为淡紫色链霉菌8006(Streptomyces lavendulae 8006),孢子丝紧密螺旋形至钩状。孢子椭圆形至柱状。08-2菌为绿色产色链霉菌783(Streptomyces viridochromogenes 783),孢子丝螺旋形。通常2-3圈。孢子椭圆形。两者具有明显差别
。
图3-308-1菌孢子丝、气生菌丝形态图3-408-1
菌孢子形态
图3-508-2菌孢子丝、气生菌丝形态图3-608-2菌孢子形态
3. 3. 3生理学特征
将08-1和08-2菌株分别接种各种生理生化试验培养基中,观察各菌株的生理生化特性,试验结果见表3-2。3
试验名称
明胶液化试验
硝酸盐还原试验
淀粉水解试验
甲基红试验
V -P 试验
H 2S 产生试验
石蕊牛奶试验
纤维素分解实验结果记录08-1菌明胶不液化不还原不明显阴性变红阳性产生黑色沉淀产H 2S 变蓝产碱不分解08-2菌明胶很快液化还原作用很强水解很弱阴性变黑阴性产生黑色沉淀产H 2S 变红产酸不分解
3. 4本章小结
按照阎逊初主编的《放线菌的分类和鉴定》手册对两株产螺旋型孢子丝的放线菌进行了传统分类。经过形态观察和生理生化试验初步鉴定两株菌分别为淡紫色灰链霉菌8006(Streptomyces lavendulae 8006)和绿产色链霉菌783(Streptomyces viridochromogenes 783)。
4结论
08-1菌为淡紫色灰链霉菌8006(Streptomyces lavendulae 8006),孢子丝紧密螺旋形至钩状。孢子椭圆形至柱状。
08-2菌为绿色产色链霉菌783(Streptomyces viridochromogenes 783),孢子丝螺旋形,通常2-3圈。孢子椭圆形。
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Isolation and identificaion of several Actinomycete strains for teaching
Fan Xinjiong
(The School of Life Science ,Sun Yat-sen University ,Guangzhou 510275)
【Abstract 】Two Actinomycetes strains 08-1and 08-2were isolated from soil samples collected in Yantai University ,Shandong Province.Based on polyphasic studies ,including their morphology ,physiological and biochemical characteristics ,chemotaxonomy ,08-1and 08-2were identified as two species of Actinomycetals :Streptomyces lavendulae 8006and Streptomyces viridochromogenes 783,respectively.
【Keywords 】Actinomycetes ,identification ,chemotaxonomy 3