叶绿素的提取与分析测定

植物叶绿体色素的分析

一、实验目的：

1、学会叶绿体色素的分离方法。

2、掌握叶绿素的定量测定。一、

3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。

二、实验原理：

1、叶绿体色素的提取：

（1）原理：

叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般

由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。

叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研

钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤

分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。

（2）步骤：

称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳酸钙和石英砂,

研磨成匀浆,再加入20ml丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用

2、叶绿体色素的分离：

（1）原理：

叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。

当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分

配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。

（2）步骤：

1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线

(见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内，如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。

2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封

住层析缸,直立于暗处层析。

3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后是兰绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。

如图所示：

3、叶绿体色素的性质

（一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态（激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光的颜色是红色的。由于荧光的光强度很弱只能在反射光的方向可以看到。如果我们将提取液放入试管中，观察反射光和透射光的颜色，反射光的颜色即为叶绿素产生荧光的颜色为血红色。【如右图：

】

（二）氢代叶绿素&铜代叶绿素：

C55H72O5N4Mg+H+===C55H74O5N4+Mg++

H+C55H72O5N4Mg+Cu++===C55H72O5N4Cu+Mg++

叶绿素取上述提取液少许于试管中，加入2滴浓盐酸，溶液呈现褐

绿色，此时叶绿素变为去镁叶绿素。在褐绿色溶液中加入醋酸铜结晶少

许，渐渐加热直至鲜绿色产生，这时铜已在叶绿素分子中代替了Mg的

位置。

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（三）皂化作用：

叶绿素是含有两个酸根的酯，加碱可发生皂化反应，得到叶绿酸的盐、甲醇和叶绿醇，

叶绿酸盐可溶于水。

取3ml色素提取液，加lm120%KOH甲醇溶液,小心加热到沸腾,冷却后,加入2ml苯,混匀，加入3m1水静止后得到两层溶液,上层是苯的胡萝卜素和叶黄素溶液，下层是叶绿酸a和叶绿酸b的钾盐溶液。

另外在3ml上述色素提取液中直接加2ml苯，混匀，加入3ml水，对比皂化和没皂化溶液有何不同。照相记录实验结果。

（左图为皂化溶液，右图没皂化）

4、叶绿体色素的定量分析：

叶绿体色素能够吸收一定波长的光，而让其他波长的光透过，这是叶绿体色素的光学特征之一,

将色素的吸光度对波长作图，所绘制的曲线称为吸收光谱曲线。

叶绿素在80%的丙酮溶液中，在长波方面的最大吸收峰分别位于663nm和645nm,同时该波长叶绿素的比吸收系数k为已知,根据Lambert-Beer定律,溶液中叶绿素浓度C与溶液的吸光度A之间的关系式为：

A663=82.04Ca十9.27Cb(1)

A645=16.75Ca＋45.6Cb(2)

解方程(1)(2),则得:

CA(mg/L)=12.7A663-2.69A645

CB(mg/L)=22.9A645-4.68A663

CT(mg/L)=CA+CB=20.2A645+8.02A633

计算叶绿素提取液的浓度，并根据提取液的体积植物组织的鲜重，算出样品中叶绿素a和叶绿素b的含量mg/g。

样品中叶绿素a含量（mg/g）=提取液叶绿素a浓度（mg/L)*提取液体积（L）/叶片重量（g）样品中叶绿素b含量（mg/g）=提取液叶绿素b浓度（mg/L)*提取液体积（L）/叶片重量（g）

5、叶绿体色素的吸收光谱：

叶绿体色素对可见光有吸收，测定叶绿素提取液对400～700nm波长的吸收，了解叶绿素提取液对400～700nm的可见光的吸光度同光的波长之间的关系。

要求分别测定叶绿体色素、分离后的叶绿素a和叶绿素b

的吸收光谱。

三、实验材料：

菠菜(Spinaciaoleracea)

四、实验步骤：

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.定性色素提取定量色素提取层析荧光现象氢、铜在叶绿素分子中的代替作用皂化反应定量测定吸收光谱

五、计算：

样品中叶绿素a含量mg/g=CA*V/m

其中:CA：叶绿素a浓度,mg/l;

V：叶绿素a提取液的体积,ml

M：测量叶片的重量,g

样品中叶绿素b含量mg/g=CB*V/m

其中:CB：叶绿素b浓度,mg/l;

V：叶绿素b提取液的体积,ml

M：测量叶片的重量,g

样品中叶绿素含量mg/g=CT*V/m

其中:CT：叶绿素浓度,mg/l;

V：叶绿素提取液的体积,ml

M：测量叶片的重量,g

六、思考题：

1、叶绿素在蓝光区也有吸收峰，能否用叶绿素在蓝光区的吸收峰对叶绿素进行定量分析？为什么？

答：不能。因为定量分析的吸收峰必须要稳定，还要有强的吸收。另外，还需要考虑干扰的问题。有关叶绿素定量分析方法很多，因此，在有其它灵敏方便的定量分析方法的情况下，一般不考虑这个吸收峰。

2、在研磨提取叶绿素时向研钵中加入碳酸钙的作用是什么？

答：加入碳酸钙是为了中和有机酸，防止叶绿素被破坏。

七、小结：

通过本次实验，我学会了叶绿体色素的分离方法，掌握了叶绿素的定量测定。了解了高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。在本次实验中我们组进行了叶绿素定性提取、定量提取、层析、荧光现象、氢、铜在叶绿素分子中的代替作用、皂化反应、定量测定、吸收光谱等实验操作。基本上达到了本次实验目的和要求。