生物分析用近红外荧光染料研究进展X
第20卷第5期
2003年5月
精细化工
Vol.20,No.5May2003
FINECHEMICALS
生物工程
生物分析用近红外荧光染料研究进展
施 锋,李宏洋,彭孝军
(大连理工大学精细化工国家重点实验室,辽宁大连 116012)
Ξ
摘要:概述了用于生物分析领域与生物分子共价结合的近红外荧光染料,包括菁染料(含多次甲基菁、方酸菁和克酮酸染料)、酞菁、罗丹明及荧光素等,对其结构、光谱性能、应用等方面进行了综述,对发展前景进行了预测。关键词:近红外荧光染料;共价结合标记;DNA
中图分类号:TQ628.2 文献标识码:A 文章编号:1003-5214(2003)05-0268-05
DevelopmentsofFluorescentDyesforBiochemistry
SHIFeng,LIHong2yangG2jun
(StateKeyLaboratoryofFineChemicals,DalianU,DalianChina)
Abstract:dyesinbiochemistry,thispaperfocusedontheN,andsomesuggestionswereputforwardonthefutureresearch.Thisintroduceddyeswhichareusedforcovalentlabelingofchemicallymodifiednucleicacids,andpaidattentiontothepropertiessuchasmaximumabsorptionwavelengthandtheabsorptionintensity.Attentionwaspaidtothenearinfraredfluorescentdyesasfollows:cyaninedyeswhichincludedpolymethinedyes,squaryliumandcroconiumdyes,phthalocyanines,rhodaminesandfluoresceins.
Keywords:nearinfraredfluorescentdyes;covalentlabel;DNA
Foundationitem:Grantedbythe”973program”oftheministryofscienceandtechnologyofChina
andnationalsciencefoundationofChina(project20128005)
荧光检测技术在DNA杂交测试、免疫检测、基因重组检测和肿瘤细胞早期诊断等方面的广泛应用,极大地促进了近红外荧光染料的发展。仅过去几年间就有大量文献和专利对这类功能性染料的研究及应用进行了报道。
近红外荧光染料的发射波长为700~1200nm,在该范围内生物分子自身荧光较弱,可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度。根据与生物大分子的结合方式可将近红外荧光染料分为共价键结合式和非共价嵌入式,共价键结合的标记物比由非共价嵌入所得的复合物更稳定[1]。作者主要介绍共价结合的近红外荧光染料。其检测原理是:通过活性基团〔如:琥珀酰亚胺(NHSester)、异腈酸酯(NCS)或邻苯二甲酰亚胺等〕与蛋白质、DNA、核酸或其他生
物大分子中的羟基、氨基或巯基以化学键的方式键
合,使染料荧光特性发生变化,借此提供大分子结构和性能的信息[2]。这类染料包括菁染料、酞菁、罗丹明及荧光素等。
1 近红外荧光染料
1.1 菁染料
菁染料以往主要用作感光材料中乳化银的光谱增感剂[3]。近年来已逐渐应用在红外激光染料、光盘存储材料、非线性光学材料和生物大分子荧光标记等方面[4~6]。菁染料摩尔消光系数为150000~250000L・mol-1・cm-1,量子产率适中,通过调节共轭链的长度或修饰染料的结构,可改变菁染料的光谱性能[7],使其配合Ga-As二极管激光器(780~830nm)的应
Ξ收稿日期:2002-12-30
基金项目:国家重点基础研究专项经费资助;国家自然基金资助(项目批准号:20128005)作者简介:施 锋(1976-),女,黑龙江大庆人,大连理工大学博士研究生,电话:0411-3631333转3594。
第5期施 锋,等:生物分析用近红外荧光染料研究进展
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用,成为生物分子检测中的常用染料[8]。
菁染料包括多次甲基菁、方酸菁和克酮酸菁等。一般多次甲基菁染料λem为700~900nm,摩尔消光系数较高,按甲川链的数目可分为Cy3至Cy7,但这类染料光稳定性较差。随甲川链的增长及母体环碱性的增λ大,在甲em有相应红移,但染料光稳定性显著下降。川链上引入不饱和环,使链被相对固定,可提高染料的稳定性[9]。水溶性基团的引入可增加染料的溶解性、减少在溶液中的聚集,并改变与底物结合后的光谱性能[10]。目前的研究工作集中在如何使该染料的λem产生较大红移,并减少对其光热稳定性的影响。图1是近几年合成的多次甲基菁染料[2,11]
。
表1 染料在甲醇中的吸收和荧光特性
荧光染料
IR700-OH
IR700-COOHIRD800XD-205IRD41Cy5吸收发射λab/nmλem/nm
[***********][***********]斯托克斯位移
/nm[1**********]1摩尔消光系数量子产率
Qf/%ε/(L・mol-1・cm-1)
170000
[***********][1**********]047.736.415.07.0714.128.0方酸菁和克酮酸菁染料可看成是方酸或克酮酸做桥基的菁染料。方酸和克酮酸基团的引入可使菁染料的λem产生较大红移。方酸菁染料光化学性能优异、吸收强度大、光热稳定性好,通过改变侧链取代基可使λmax从500nm变化到1400nm以上。许多方酸菁染料在近红外区有强烈的荧光发射,适用于生命活性物质的分析,包括免疫分析、DNA测序[12]。等人首次用含有。1994年,NHS酯基的不对称方酸菁染料,并用其标记牛血清蛋白,也达到较高的灵敏度[13,14]。图2为几种近红外方酸荧光染料[2]
。
图1 近几年合成的多次甲基菁染料
图2 几种近红外方酸荧光染料
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克酮酸染料比相应的菁染料更稳定,λab和λem
红移约100nm,与方酸菁染料一样,克酮酸染料与蛋白质结合后量子产率也提高较多,如:Sq660和Sq635[15]2种染料的量子产率可从与蛋白质结合前的011变化到结合后的0168。这类染料能与760nm的二极管激光器很好匹配,是较有前景的荧光
染料之一。1.2 酞菁类荧光染料
酞菁的问世已有近百年的历史,它具有独特的物理化学性能。在酞菁的基本结构中,周边取代的官能团可以是氢原子、烷基、苯并基团、杂环等,中心可容纳Ni、Zn、Pt、Pd、Al、Si、Ge等原子[16]。
酞菁有2个主要吸收带:紫外区的B带和可见及近红外区的Q带,其吸收强弱与卟啉相反。酞菁的B带为弱吸收而Q带吸收较强。Q带受稠环个数、取代基数目的影响,一般分布于650~850nm,较卟啉Q带红移100~200nm。
器激发,啉(21)(Zn和Pd络合物)在长波长区有较高的光化学稳定性,且λab和λem较长,适用于二极管激光器。
与卟啉相比,酞菁对光、氧和热有较好的稳定性。这类染料在有机光导体、电子照相、激光印刷系统中有广泛应用。在光动力学疗法中作为光敏剂也有报道。水溶性酞菁以其独特的吸收和荧光特性在生化分析中的应用正日趋广泛。较深的色光和对蛋白质非特异性的强吸附使其被用作新型的蛋白质染色剂;较高的荧光量子产率和较大的stock位移(>300nm)使其在荧光免疫分析中被用来标识抗体或在DNA杂交中用作DNA探针[18]。
许金钩研究组[19]以四磺酸基铝酞菁为荧光探针,建立了血清蛋白、白蛋白及球蛋白连续测定的方法,并研究了酞菁与牛血清白蛋白的相互作用。该组还分别以四胺基铝酞菁、四磺酸基铝酞菁为荧光探针建立了测定强酸和溶液pH
的荧光分析方法。近红外吸收极化探针LaJollaBlue[20](23a)是一种硅酞菁衍生物,λem=680nm,量子产率70%,具有良好的光稳定性。由于中心嵌入的硅原子为+4价,与酞菁环上的氮原子配位后,还可通过轴向配位引入水溶性基团以增进水溶性并防止染料在溶液中聚集。一些硅酞菁衍生物(23b~23e)也已用于荧光免疫分析中标示蛋白质。酞菁类染料的缺点是合成中溶解度小、体积大,会影响生物分子其他性能。
图3 几种酞菁类荧光染料
1.3 荧光素、罗丹明及其他荧光染料
荧光素染料量子产率高、光稳定性好,但Stock位
移小;多数罗丹明染料λab和λem在600nm以下,荧光量子产率低、寿命短,不易通过活性基与生物分子结合,生物应用有一定困难。最近,一些新型罗丹明染料问世[21],其波长在620~670nm,可与通用二极管激光器匹配。罗丹明染料结构稳定,常用作荧光素的代替物,图4列出一些新型的罗丹明类荧光染料。
第5期施 锋,等:生物分析用近红外荧光染料研究进展
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图5 Benzo[a]phenoxazine染料衍生物
2 应用
2.1 DNA测序
DNA测序是人类基因组测序的前提。在最近
几年里,DNA序列测定在医学、分子生物学等领域
得到广泛应用。荧光检测提供了比传统的同位素辐实用的,可实现测,荧。,这无论对顺序测序法还是杂交测序法都相当有意义[23,24]。2.2 免疫分析荧光免疫分析是将免疫反应的特异性和荧光技术的灵敏性相结合的一种分析方法,基本原理是将特异性抗体和抗原标记上荧光基团成为特异性试剂,与相应的抗原或抗体结合,形成抗体抗原复合物,再用荧光检测仪检测荧光的各项参数变化从而获得样品中抗体或抗原的分布、浓度等信息[25]。2.3 分子信标:用于基因检测的荧光杂交探针[26]
疾病分子生物学研究结果表明:困扰人类的主要疾病,如:癌症、心血管疾病、微生物感染,甚至肥胖、糖尿病等均由基因遗传所引起;而基因表达研究、药物筛选、药效评价以及致病基因检测等都涉及核酸的定量检测。常规的核酸检测法操作繁琐、技术难度大,而且准确度低,更不能对活体核酸进行研究。最近发展起来的分子信标技术为核酸检测提供了新途径,它具有操作简单、灵敏度高、特异性强、可实时检测、甚至动态监测活体核酸等优点[27]。分子信标是一种基于荧光共振能量转移现象设计的发卡型寡核糖酸探针,空间上呈茎环结构:茎的一端连接荧光分子,另一端连接猝灭分子,通过空间结构变化来改变分子信标的荧光特性,从而实现对核酸检测。
图4 一些新型的罗丹明类荧光染料
用N原子取代 吨染料的中心碳原子,可得到
口恶嗪类染料。由于N原子的吸电子作用,能使波长红移80nm,但同时造成了量子产率和摩尔消光系数的下降。该类荧光染料已被用作生物探针,其中benzo[a]phenoxazine染料衍生物结构如图5所
示[22]
。
3 展望
(1)以荧光染料标记核酸分子、制备基因探针、
进行DNA测序,这是荧光分析的前沿领域。其发
・272・
第20卷 精细化工 FINECHEM ICALS
17.
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展将为基因工程、基因的诊疗提供有效的检测手段,
将极大地推动生命科学的发展并将分子生物学带入一个全新的局面。长波长、高量子产率的近红外荧光染料的开发不仅有利于生命科学的发展,而且有望成为新的临床诊断技术,具有广阔的产业化前景。
(2)荧光共振能量转移技术使生物大分子中不同波长荧光标示染料利用二极管激光器在单一波长下进行检测成为可能,可大大降低操作成本,从而推动生物分子分析的发展。
(3)我国搞染料合成的化学家与分子生物学家、物理学家和医学家要携起手来,设计并合成更新、更好的核酸染料,弥补我国这方面的空白并赶超国际先进水平。参考文献:
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