总糖含量的测定
总糖含量的测定
一、目的:
1.掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。 2.学习植物可溶性糖的一种提取方法。 二、原理:
糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后,与蒽酮(C14H10O)脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收,在150 µg/ml范围内,其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度,糖含量在30 µg左右就能进行测定,所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下,采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器:电热恒温水浴锅,分光光度计,电子天平,容量瓶,刻度吸管等 2.试剂:
(1)葡萄糖标准液:l00 µg/ml (2)浓硫酸
(3)蒽酮试剂:0.2 g蒽酮溶于100 ml浓 H2SO4中。当日配制使用。 3.材料:淀粉 四、操作步骤
1.葡萄糖标准曲线的制作
取7支试管,按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液:
管号
葡萄糖标准液(ml) 蒸馏水(ml) 葡萄糖含量(µg)
1 0 1 0
2 0.1 0.9 10
3 0.2 0.8 20
4 0.3 0.7 30
5 0.4 0.6 40
6 0.6 0.4 60
7 0.8 0.2 80
在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖,以防蒸发。自水浴重新煮沸起,准确煮沸l0 min
取出,用冰浴冷却至室温,在620 nm波长下以第一管为空白,迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量(µg)为横坐标,以吸光值为纵坐标,作出标准曲线。
2.植物样品中总糖的提取:
精确称取0.5g,置于50 ml三角瓶中,加水15 m1,盐酸10ml,沸水浴20min,定容至100ml,得提取液。取10ml滤液定容至100ml
3.测定
吸取1 ml已稀释的提取液于试管中,加入4.O ml蒽酮试剂,平行三份;空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量(µg)。
五、结果处理
C × V总 × D
样品含糖量(%)= ───────────── × 100 W × V测 × 106 其中:C——在标准曲线上查出的糖含量(µg),
V总——提取液总体积(ml),
V测——测定时取用体积(ml), D——稀释倍数,
W——样品重量(g), 6
10——样品重量单位由g换算成µg的倍数
六、注意事项:
该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物,不但可测定戊糖与已糖,且可测所有寡糖类和多糖类,包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值,但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时则可避免此种误差。
试验注意
1,样液必须清澈透明,加热后不应有蛋白质沉淀 2,样品颜色较深时,可用活性炭脱色后再进行测定 3,此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关 4,所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间