动物荧光定量PCR检测方法
动物组织基因组DNA提取试剂盒
一、实验前准备
(一)、分装反应液(以鸡鸭源为例)
1、将反应液(GA )与Bst 聚合酶离心15s ,取出,在反应液中加入Bst 聚合酶全部加入到反应液(GA )中离心15s ,将其分装小管中,每个管分23µL 。一般分到24-26个。
2、分装完毕,取密封液加入每个小管中各一滴(所取密封液的枪一定要竖直加入)。
3、全部完毕后将其和试剂盒放到-20℃冰箱中保存。:
注:①每一种试剂盒中,出来反应液与对应的阳性对照不可混用外,其他三种均可通用。 ②每一试剂盒中都有反应液、Bst 聚合酶、密封液、阴阳对照五种试剂。
(二)、试验中试剂的准备
1、Proteinase K:加入600µL Protease Dissolve Buffer至Proteinase K管子中,颠倒混匀使蛋白酶K 充分溶解,保存于-20℃。
2、Buffer GW1:加入14mL 无水乙醇。
3、Buffer GW2:加入40mL 无水乙醇。
注:每一种试剂盒上都有相应的说明。Buffer GW1和Buffer GW2加入无水乙醇的量按说明书操作。
二、动物组织DNA 提取
1、取30-100µL Buffer AE(这是一个样品的量,具体量取决于自己做的实验样品的个数),于70℃中预热,备用。
2、取1-20mg 的样品,将其剪切成尽量小的碎片,转移到1.5mL 的离心管中。加入230µL Buffer MTL和20µL Proteinase K,涡旋混匀。55℃水浴1-3h (具体时间看样品的消化情况)。水浴期间要时常将样品涡旋混匀。
注意:取样量不可以太多,过多会降低产量与纯度。脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA ,不宜超过10mg 。肌肉和皮肤可相应增加到30mg 。
3、加入5µL RNase Solution(RNA 裂解酶)(枪身不要碰着RNase Solution)至消化液中,涡旋混匀。室温或37℃水浴锅中放置15-60min 降解RNA 。
4、13000r 离心3min 。取上清液至新的1.5mL 的离心管中。
5、加入250µL Buffer AL 至消化液中,最高速度涡旋混匀30s 。70℃水浴
10min 。
6、加入250µL 无水乙醇至消化液中,最高速度涡旋混匀30s 。
7、把DePure gDNA Mini Column装入2mL 收集管中。转移6中的混合液(含沉淀)至柱子中。10000r 离心1min 。
8、倒弃滤液,把柱子装回收集管(转动一下突起拿下收集管)中。加入500微升Buffer GW1至柱子中,10000r 离心1min 。
9、倒弃滤液,把柱子装回收集管中。加入500微升Buffer GW2至柱子中,10000r 离心1min 。
10、倒弃滤液,把柱子装回收集管中。再加入500微升Buffer GW2至柱子中,10000r 离心1min 。
11、倒弃滤液把柱子装回收集管。13000r 离心2min 去除柱子中残留的乙醇。
12、将柱子转移至新的1.5ml 离心管中。加入30-100µL 已经预热到65℃ Buffer AE 至柱子的膜中央(枪头靠近底部,打入即可,不要碰到底部。同时枪头不要碰到柱子)。室温静置3min 。10000r 离心60s 。
13、再加入30-100µL 已经预热到65℃ Buffer AE (量为第一次的一半即可) 至柱子的膜中央(枪头靠近底部,打入即可,不要碰到底部。同时枪头不要碰到柱子)。室温静置3min 。10000r 离心60s 。
14、丢弃DNA 结合柱,将DNA 保存于-20℃。备用。
注意:二过程中的每一步加液时,都不要吹打。拿离枪时,不要使枪放开。