课题6血红蛋白的提取和分离(学案)

B．（1）

（2）洗脱开始， 的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内； 省海中高二生物（选修）教学学案

课题6 血红蛋白的提取和分离

一、达标

（一）知识目标

知识与技能: 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物

大分子的基本原理

过程与方法: 体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关

步骤

情感态度与价值观: 初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

（二）重点和难点：

重点: 凝胶色谱法的原理和方法

难点: 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

二、基础知识

（一）原理 1．凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由 构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 具体过程： （1）

（2） （3） （4） （5）

颗 粒

A

A．作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。 第 12 页

的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外； （3） 的蛋白质被滞留； 的蛋白质被向下移动。 （4） 不同的蛋白质分子完全分开； （5） 的蛋白质行程较短，已从 中洗脱出来， 的蛋白质还在行进中。 2．缓冲溶液 缓冲溶液的作用是 。缓冲溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是 ，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。 思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 3．电泳 （1）概念：电泳是指 。 （2）原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有（ ） 在（ ）下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。

两种常用的电泳方法是 和 ，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移

率取决于 以及 等因素。 4．蛋白质的提取和分离 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ 5．样品处理

血液由 和 组成，其中红细胞最多。红细胞具有 的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质，其作用是链环绕一个 ，磁基团可携带 。血红蛋白因含有 呈现红

色。

红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，

将下层暗红色的 倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。 血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体，是 ，第3层是红色透明液体，这是 ，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中 的杂质，或用于更换样品的 。 6．凝胶色谱操作 第一步要制作 ，第二步要 ，因为 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有 存在。因为气泡会 ，降低分离效果。第三步是 。 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快 实验操作 1．样品处理 （1）红细胞的洗涤 ①目的：去除（ ） ②方法：（ ）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（ ），将下层（ ）的红细胞液体倒入（ ）再加入用（ ）的（ ）质量分数为0．9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间） ⑥重复4、5步骤（ ）次，直至上清液中已没有（ ），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。 （2）血红蛋白的释放 加（ ）到（ ）体积，再加40％体积的（ ），置于（ ）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白． （3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 第1层（最上层）：（ ）甲苯层 第2层（中上层）：（ ）的沉淀层，（ ）色薄层固体 第3层（中下层）：（ ）的水溶液层，（ ）的液体 第 13 页

第4层（最下层）：其它杂质（ ）的沉淀层 （4）透析

2．凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1．6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔； b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（，在0．5ml的（ ）头部切下（ 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c、剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（ 的尼龙纱将橡皮塞（包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头部做（，连接一细的（，并用螺旋夹控制尼龙管的（ ），另一端放入收集（ ）的收集器内

③顶塞的制作： 插入安装了玻璃管的橡皮塞 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择：（ ）。

（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（ ）。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 ① 固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 ③洗涤平衡

装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（ 300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分（ ）12小时。 3）样品加入与洗脱 （1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与

（ ）平齐，关闭出口 （2）加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ）

④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱

⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集

思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。 3．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 电泳方法步骤

1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备 3）样品处理： 4）把凝胶固定于电泳装置上

5）加样：按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后（即进行凝胶色谱分离之前）的样品和凝胶色谱分离之后的样品

6）电泳 7）剥胶 8）染色 9）脱色 10）观察结果 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 三 实验结果分析与评价

观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 讨论：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。

四、突破训练 一．选择题

1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A．分子的大小 B．相对分子质量的大小 C．带电荷的多少 D．溶解度

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2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。

A．温度 B．pH C．渗透压 D．氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A．相同 B．相反 C．相对 D．相向 4．哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A．血红蛋白 B．肌红蛋白 C．肌动蛋白 D．肌球蛋白 5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A．白细胞 B．血小板 C．红细胞 D．淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂 A．NaCl B．甲苯 C．蒸馏水 D．柠檬酸钠

7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是

A．无色透明的甲苯层 B．脂溶性物质的沉淀层 C．血红蛋白的水溶液 D．其他杂质的暗红色沉淀物 8．凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是 A．分子的大小 B．相对分子质量的大小

C．带电荷的多少 D．溶解度 9．利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是 A．相对分子质量大的 B．溶解度高的

C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的 10． 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是 A．糖类化合物 B．脂质 C．蛋白质 D．核酸

11．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 （ ）

12．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快

13．能进入凝胶内部通道的蛋白质是指 A．相对分子质量大的 B．吸附性高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的 14．凝胶色谱法中移动得快的是

A．相对分子质量大的B．溶解度高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的

15．缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的 A．温度 B．pH C．渗透压 D．氧气浓度 16．初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为

A．H2 CO3一NaHCO3缓冲液 B．NH4OH—NH4Cl缓冲液 C．CH3 COOH—CH3 COONa缓冲液 D．H3PO4缓冲液 17．蛋白质提取和分离分为哪几步

A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

18．血红蛋白因含有什么物质而呈红色 A．O2 B．CO C．CO2 D．血红素

19．将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是 A．甲苯 B．血红蛋白水溶液

C．脂溶性物质的沉淀层 D．其他杂质的沉淀

20．分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于 A．一 B．二 C．三 D．四

21．下列操作正确的是

A．分离红细胞时采用低速长时间离心

B．红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D．透析时要用20mmol/L的磷酸缓冲液，透析12h

22．使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决于 A．电荷的多少 B．分子的大小 C．肽链的多少 D．分子形状的差异 23．洗涤红细胞的目的是 A．去除血清 B．去除杂蛋白 C．除去血小板 D．除去水

24．洗涤红细胞时，分离所用的方法为 A．低速长时间离心 B．低速短时间离心 C．高速长时间离心 D．高速短时间离心 25．SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是

A．增大蛋白质的相对分子质量 B．改变蛋白质的形状

C．掩盖不同种蛋白质问的电荷差别 D．减少蛋白质的相对分子质量

26．制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是 A．移液管头部5 cm B．移液管尾部5 cm C．移液管头部3 cm D．移液管尾部3 cm

27．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是 A．先加入1 mL透析后的样品

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B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出

C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功 D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

28．在下列哪一种条件下生物大分子具有的可解离的基团会带上正电或负电 A．一定温度 B．一定pH C．一定压强 D．一定容器

29．电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是 A．相同 B．相反 C．相对 D．相向

30．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应 A．先打开后关闭 B．关闭 C．先关闭后打开 D．打开

31．D亚铁血红素基团可携带

A．一分子CO B．一分子NO C．一分子O2或CO2 D．一分子NO2 32．人体正常的血红蛋白中应含有Fe2+，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe2+。转化为Fe3+，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中

A．亚硝酸盐是还原剂 B．维生素C是氧化剂 C．亚硝酸盐被氧化 D．维生素C将Fe3+还原为Fe2+

33．加有少量柠檬酸钠（防止血液凝固）的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30 min后离心。下列叙述中，正确的是

A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞 B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞 C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞 D．②和③试管的上清液是血清

34．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是 A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和 C．防止血红蛋白被02氧化

D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

35．在盛有红褐色的Fe（OH）3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明

A．Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，向阴极移动 B．Fe（OH）3胶体粒子带负电荷，向阳极移动 C．Fe（OH）3胶体粒子带正电荷，向阳极移动 D．Fe（OH）3胶体粒子带负电荷，向阴极移动

36．下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是 A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

37．凝胶色谱法操作正确的是

A．将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴

B．将橡皮塞下部切出凹穴

C．插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面

D．将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片 38．样品的加入和洗脱的操作不正确的是

A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

39．下列说法不正确的是

A．血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌 B．血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体 C．血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物

D．血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液 二、多选题

40．选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是 A．血红蛋白是有色蛋白 B．红细胞无细胞核 C．红细胞蛋白质含量高 D．红细胞DNA含量高

41．下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞

B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。 C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白

D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来

42．凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1．6 cm，有关说法中，正确的是 A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果 B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果 C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度

D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大

43．下列有关提取和分离血红蛋白的过程的叙述中，正确的是 A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B．通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D．可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 血红蛋白的纯度

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44．雄性激素是小分子脂溶性物质，很容易穿过细胞膜。睾丸每天分泌的雄性激素约7 mg，其中约2％呈游离状态，其余在血中与血浆蛋白呈可逆性结合。下列有关雄性激素与血浆蛋白结合后的作用的叙述中，正确的是

A．使其不容易通过肾脏排出 B．使其不容易进入细胞 C．使其有效浓度处于特定水平 D．抑制雄性激素发挥作用

45．下列叙述中错误A．改变NaCl溶液的浓度只能使．．

的是 DNA溶解而不能使其析出 B．在沸水浴中，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色

C．加盐和加酒都能抑制微生物的生长 D．密封瓶口前最好将瓶口通过火焰以防杂菌污染

46．电泳利用了待分离样品中各种分子及 的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

47．分离血红蛋白溶液时，将混合液离心后可看到试管中的液体分为4层：第一层为______，第二层为______固体，是______的沉淀层，第三层是______液体，是______的水溶液，第四层是其他杂质的______沉淀物。

48．细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：

（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：______、______、______和______。 （2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①加入柠檬酸钠的目的是__________________。

②以上所述的过程即是样品处理，它包括______、______、收集血红蛋白溶液。

（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。 ①透析的目的是__________________。

②透析的原理是______________________________。

（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是______________________________。

②血红蛋白有什么特点？______________________________。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？______________________________________________________。

49．早在上世纪六十年代，在美国的黄石国家森林公园发现了一种嗜热细菌，从这种细菌中分离提取了一种酶，称为TaqDNA聚合酶。实验得知PCR反应变性时温度为950C，经50个循环后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性； TaqDNA聚合酶表现为Mg2+依赖，浓度在2．0mmol/L的MgCl2能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性 ；

（1）若要培养嗜热细菌，培养基中应有水、碳源、 、 等营养物质。在此基础上，培养该菌时需先将培养基 。

（2）若将培养细菌的培养基用于植物组织培养，还应加入 。

（3）TaqDNA聚合酶可用于PCR，原因是该酶有 ，因此在PCR扩增时可以 加入。

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（4）请将下列实验流程图补充完整：

（5）凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。

①凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的 不同而实现分离的：

②使用电泳法分离蛋白质．是利用了待分离样品中各种分子的 差异，以及分子本身的 、形状的不同。

50．（8分）《“十一五”将建12项重大科技基础设施》被2007年12月28日评为2007年国内十大科技新闻之一，其中的12项中的一项为“蛋白质科学研究设施”。这是由于随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因测序工作的完成，人类跨入了蛋白质时代。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

（1）蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________、________、_________和纯度鉴定。 （2）如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠

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檬酸钠，这样做的目的是__________________________________。

（3）血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、______________、分离血红蛋白溶

液和_______。其中分离血红蛋白溶液时需要用到_______（仪器）分出下层红色透明液体。

（4）装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。

这是因为____________________________________________。

49（8分）（每空1分） （1） 氮源 无机盐 pH调至中性或微碱性 （2） 植物激素（3）热稳定性 一次性 （4） 血红蛋白的释放 凝胶色谱柱的填充 （5）①移动速率 ②带电性质 大小

50答案：（1）样品处理（1分） 粗分离（1分） 纯化（1分） （2）防止血液凝固 （1分） （3）血红蛋白的释放（1分） 透析（1分） 分液漏斗（1分） （4）气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果（1分）