细胞培养相关实验步骤
细胞培养相关实验
1、复苏细胞步骤：
从-80℃冰箱或者-196℃液氮罐中取出细胞（握手心），快速放在37℃水浴箱（提前预热至37℃）轻轻摇晃至变成溶液。吸取细胞溶液至培养瓶，加入4ml 含10%胎牛血清（FBS）的培养液（DMEM/1640），放37℃、5%CO2敷箱中孵育。 快溶的理由：复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。一般细胞复苏第二天给细胞换液。
2、细胞换液的步骤：
准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1） 从孵育箱取出培养瓶，直接倒去细胞培养液；
2） 用枪从离心管中吸取4ml 含10%FBS的DMEM/RPMI 1640，加入培养瓶中；
3） 酒精喷洒消毒后放入37℃敷箱孵育。
一般2天左右更换细胞培养液，刚复苏的细胞第二天更换培养液。
3、细胞传代的步骤：
准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、FBS，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）直接倒去培养瓶内的培养液；
2）加入PBS 2ml清洗培养瓶内细胞2次；
3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；
4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；
5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；
6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，后倒去上清液；
7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞；
8）细胞分装传代100～500ul/瓶培养，可按1:（2～4）传代，后加入4～5ml含10%FBS培养液，放入37℃ 5%CO2敷箱中孵育。
4、细胞冻存的步骤：
1）离心后的细胞加入冻存液（DMSO：FBS：DMEM=1:3:6）吹打成单细胞悬液，加入冻存管1ml/管，A、放4℃30分钟，-20℃30分钟，-80℃过夜或者-196℃液氮罐永久保存；或者B、放装有异丙醇的冻存盒直接放-80℃冰箱冻存。 细胞慢冻的理由：当细胞冷到0度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞器逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
二甲基亚砜（DMSO）的作用：是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温(-200℃)保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。
5、防止细胞污染的一些操作：
1、使用前，操作台用75%的酒精擦拭2次，确保台面干净整洁；
2、操作台使用前用紫外线消毒20～30分钟，不易过长（把除了试剂外的所有用具紫外线消毒）；
3、所有的试剂在放入操作台前必须用75%的酒精喷洒消毒；
4、所有试剂打开的盖子朝下，避免手套接触盖子后被细菌污染；
5、所有的试剂用完马上把盖子盖上，不要长时间暴露在外；
6、所有的试剂使用完毕后瓶口用封口膜贴住防止污染；
7、台面如果有液体，要用消毒干净的纱布擦干净，避免污染瓶盖；
8、如果培养瓶>1月，最好更换瓶子，因瓶内有促细胞贴壁生长的成分；
9、枪头高压消毒后一般用2周左右，超过1月必须重新高压消毒。