生物分离技术笔记

生物分离技术

一、概述

1、生物分离技术的基础：生物化学、微生物学、动物、植物细胞工程。

生物分离技术的定位：下游——分离、纯化。（上游：选菌、DNA 重组、蛋白质改造；中游：发酵、表达、固化技术） 在传统发酵投资中占60%，在DNA 和蛋白质精制中占80-90%。

2、发展历史：第一阶段：1950年以前的纯培养技术，以压滤、蒸馏为主。

第二阶段：1950通气培养技术和代谢控制技术（离子交换和电泳）

第三阶段：21世纪，现代生物技术；生物分离工程。

3、分离技术及应用范围：

• 沉淀分离：盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀（PEP ） • 层析分离：吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、层析、聚焦层析和亲和等 • 电泳分离：SDS-PAGE 、等电聚焦、2D-电泳、毛细管电泳

• 离心分离：低速、高速、超速

• 膜分离：透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透

• 萃取技术（双水相萃取、超临界流体萃取、反胶束萃取）、液膜分离、泡沫分离、结晶技术等。

4、生化分离技术的特点：成分复杂、含量极微、易变性、易破坏、具有经验性和均一性； 易变性主要体现在过酸、过碱、高温、高压、离子强度和重金属离子，较低的温度和洁净的环境才下进行。生化分离方法多采用温和“多阶式”进行，“多层剥皮”的方法，现在有一种新技术“钓鱼法”，利用的是某些分子的特有的专一亲和力。 ．．

易破坏：氧化、水解、微生物污染。

由于品种多、难度大，导致成本高，所以需要考虑：产品价格；质量标准；产品与杂质的物化区别；产品流经途径是否合理；不同的分离技术方案经济指标的比较。

主要原理是用机械方法或者混合物外加一定的作用力，使各组分分配到不同的物相中。

5、生化分离的基本步骤：

1）建立分析方法：生化分离过程一旦展开，都应首先建立快速灵敏的分析方法，以保证分离工作的顺利进行，利用生物测定、理化测定或两者的结合。测定方法必须满足特异性、重现性好、准确度高、灵敏度高、时间短。

2）选择提取材料：原则是材料来源丰富、含量高（要考虑收率）、杂质少、成本低；范围包括动物植物微生物。

3）选择提取方法：选定后，要有预处理，再提取。参考第二章。

4）分离纯化方法：见后

5）均一性的鉴定：纯度鉴定主要有层析法、电泳法、超离心法，酶的鉴定还有恒比活的方法。测试方法都是相对的，所以要标明测试方法。

6、生化分离技术方案设计和选择：

0）不容物的去除阶段：过滤或离心。

1）粗化阶段：主要是出去大量的杂质，选择的方法能够满足大规模处理的需要，侧重点在速度和处理量上，一般使用均浆、沉淀技术、膜过滤技术。

2）纯化阶段：主要是进一步出去大量杂质，重点放在分辨率和处理量上，离子交换、凝胶层析在此阶段使用。

3）精制阶段：主要是除去微量杂质，重点是分辨率；采用离子交换和亲和层析技术。 原则：要保证生物活性和化学完整性。

7、发展趋势：

灌柱层析是一种快速纯化技术，POROS 填料就是他的体现；膨胀床色谱技术；

高效离子交换剂：中压层析或高压层析使用粒度较小而又一定硬度和分辨率的交换剂。

发展倾向：多种纯化技术的结合（融合技术）；分离技术与发酵工艺的结合（耦合）；新型高效分离材料的开发（分子印迹技术、智能高分子材料）；新型分离技术。

8、生物分离过程的关键技术：过滤、离心、膜分离、萃取、吸附交换、工业色谱、电泳技术、结晶、干燥、蒸馏与精馏技术。

二、预处理

1、样品分离的预提取过程

1）植物组织提取物的制备：

植物中酶的提取必须从含有酚、多酚的植物组织中提取，而大量酚的存在给提取带来了困难。酶、酚在植物组织中处于间隔状态，当植物组织破坏后，酚、酶混合接触，发生反应，反应产物苯醌和单宁酸还会继续与酶蛋白发生反应，这样的过程往往使要提取的目的酶失去活性.

注意：提取液的量一定保证“充分侵入”；搅拌适当；PH 值5.5-7

二、动物细胞提取：

1、器官的选择：

在不同的器官中，蛋白的数量是不同的，如心脏容易得到澄清液，而肝脏的核酸和脂肪（包括可溶性蛋白）要多些；刚宰杀的器官要去除脂肪和筋皮，马上放入-10℃的冷库中。 脂肪本身容易氧化酸败，导致变质，还会影响后期纯化。一般的脱脂方法有：人工去除脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂中脱脂；快速高温、快速冷却除油块；油脂分离器。 如果蛋白质存在于亚细胞中，如线粒体，亚细胞分离会很容易，但也会限制蛋白质的量。因此大量提取的可行办法是传统方法均浆化器官。

2、注意事项

1）均浆：在机械力和渗透压的结合作用下，缓冲液中的动物细胞膜很容易被破碎。经过离心、均浆后澄清。肝、肾、心脏、脑都是容易均浆化；纤维化的需要冷冻。

2）缓冲液的选择：中性PH 值，适当离子强度（如0.1mol/L的磷酸缓冲液，PH7.0）。在静电力下，有些蛋白会黏附在碎片上，加入0.1mol/L的NaCl 会提高蛋白收率。

3）蛋白抑制剂：一般来说，蛋白浓度高，其他蛋白会保护目标蛋白；但是有些目标蛋白更易受蛋白酶的影响，纯度越高，蛋白降解会成为大问题，这完全取决于蛋白和器官的来源。使用蛋白酶抑制剂，在大规模提取时，成本会很高，所以尽量避免。理想情况是，分时段测定目标蛋白是否有可测损失，如果有，采取措施。

4）保护剂的添加：有些蛋白易氧化，需要在提取液中加入0.1mmol/L的二硫赤藓糖醇或0.1mol/L的β巯基乙醇；重金属要加入EDTA 。

5）离心条件的选择：相对离心力=1.118×10-5×n2×r;缓冲液：器官=2:1.

6）提取液的澄清：心脏类的有足够的澄清度，但是肾脏、肝、脑等在柱层析之前一定去掉颗粒物。方法首先要考虑高速离心（如果均浆液中有核酸和核蛋白引起黏度增大，而降低沉降速率，需加入聚胺类物质，如精蛋白硫酸盐g/L）；另一种方法是热沉淀。 纯化方案第一个步骤是盐析或有机溶剂沉淀，澄清问题此时可以不用考虑；但是，如果目标蛋白和其他粒子一起在盐析中沉淀，那就必须要先解决澄清问题。

3、处理过程

出冷库 解冻 切片、绞碎（3mm 送至提取罐

详解：原料标准见CG001，贮存在-10度以下；解冻2h ；切片3cm 厚，3mm 肉末；

提取液：市政水3700L ，缓加入12L 硫酸，搅拌5min ，加入48kgNaCl ，搅拌30min ；用开水调节到4000L 、25-28℃，并检测PH1.6-2.0之间。顶洗液：配置6000L 水，3L 硫酸。

处理：肉末加入到提取液搅拌3h ，再搅拌提取14-18h ，T ：16-19℃；PH ：2.3-2.6； 出料：蛋白含量在6mg/ml以上出料，过浆；

压滤：粗液每4000L 加入200Kg 珍珠岩，压滤收集清液，并顶洗。

第二章：细胞破碎

细胞破碎的难易程度不同，破碎方法也不同。

一、化学破碎方法： 要离心

化学破碎方法主要有渗透反应条件温和，但是价格昂贵，无法工业化生产；碱处理法反应剧烈，且选择性差，容易造成蛋白、酶失活，少用。 渗透冲击法：是最简单的，将一定体积的细胞液加入到2倍体积的水中，导致细胞吸水膨胀破裂。对大规模的动物细胞，特别是血红细胞，快速改变浓度十分有效。

化学渗透法：将细胞放入其2倍体积的表面活性剂中，增加细胞壁的溶解度，使之破碎。表面活性剂：阴离子（SDS 、脂肪酸盐）、阳离子（烷基铵盐“洗发剂”）、非离子（烷基苯酮醇）；增加万倍以上的溶解度，适用于大肠杆菌，但是后期要处理表面活性剂。

脂溶法：将细胞悬浮液加入到10%的甲苯（毒）中。其他如癸烷、辛醇。适用酵母类。

二、机械破碎法：其中均浆法和珠磨破碎法适用于大规模生产，超声波适用于实验室。 珠磨法是进入珠磨机的悬浮液和极细的玻璃小珠或石英砂等快速搅拌研磨时细胞破碎，在珠液分离器的作用下，珠子滞留在机器内。一般卧式优于立式，采用夹套冷却。如果提高破碎效率，需要增加珠量，延长时间、提高转速，这样总消耗增加，制冷也增加，过高的破碎效率碎片越小给后面的固液分离带来了麻烦（进料速度，细胞浓度）。用于动物细胞。 ：——高压均质仪；机器由高压泵和均浆阀组成，原理是通过高压剪切、碰撞、渗透压破碎细胞。影响因素有压力、温度、通过均浆器的次数。压力一般在30-60MPa ，压力大，破碎效果好，但是对机器的损耗也大；缺点是要循环多次才能达到效果。使用于微生物、大规模细胞破碎。

最佳的细胞破碎条件：应该从高的产物释放率、低能耗和便于后步提取三方面权衡。

第三章 沉淀技术

一、概述

沉析一般发生在过滤或离心之后。沉淀是溶质由液相沉积为固相的析出过程；本质是通过改变条件使胶粒发生聚结，降低液相中的溶解度。如是除去液相浑浊成分，沉淀起到了澄清和分离的作用；如果需要沉积在固体的成分，沉淀起到了浓缩和分离的成分。一个分离设计需要考虑两种情况。沉淀和结晶是同一个过程，都是新相析出的过程。区别两者看分子析出过程是否有序。

沉淀法特点是简单、成本低、原材料易得，在产物浓度越高溶液中沉淀越有利，收率越高；缺点是聚集多种杂质（共沉），产品纯度比结晶法低。

沉淀技术对于分离纯化是有选择性的，还要注意沉淀剂对生物活性物质是否有破坏作用。沉淀技术是利用溶解度的差异，根据结构改变溶液中的某些性质（PH 、极性、离子强度等）是溶解度发生变化。

二、沉淀方法

1. 盐析法：

1）原理：生物大分子以亲水胶体的形式存在于液体中，无外界影响是很稳定的，一是一定PH 值下显示一定的电性，静电斥力作用互相排斥；二是蛋白质周围水分子有序排列形成水合膜，保护蛋白质避免碰撞而聚沉。

一般来讲，低浓度中性盐离子对电解质物质分子表面极性基团和水活度的影响，会增加这些物质与溶剂的相互作用，使溶解度增大，这一现象成为“盐溶”现象。但是，中性盐的浓度继续增加时，它们的溶解度反而降低，以致使电解质类物质在溶液中沉淀出来，这就是盐析作用。

机理是低盐时，蛋白质表面疏水区被水分子包围，都未暴露出来，当加入大量的盐时，大量水和盐结合（盐亲水性比蛋白质大），水分子定向排列，活度减少，使蛋白质疏水区暴露，表面电荷也被中和（静电排斥作用减弱），蛋白质互相结合沉淀。

Pr+nH2O→Pr·nH2O Pr·nH 2O+ Pr·nH 2O→Pr-Pr+（m+n）H 2O ΔG0=ΔH0-TΔS0

盐浓度升高时，水被束缚，G 值降低，上式右移，Pr-Pr 聚到足够大发生沉淀。适当升高温度，可以提高盐析速度，但是要注意生物活性。

① 单一蛋白质：经验式：lgS=β-k S I S 蛋白质溶解度，β是I=0时的lgS ，I 是盐浓度，K s 是盐析常数。K s 与PH 、温度无关，依赖于蛋白质性质和离子强度；β值与蛋白质性质、盐种类、温度（）、PH 都相关，但是影响甚微（分级盐析相关），一般来说，蛋白带电荷越多，溶解度越大；原始浓度：原始浓度有双重影响，一方面影响沉淀极限，一方面增加．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．了共沉作用，原始浓度低，需用的离子强度就大，反之相反。 蛋白质浓度一般控制在．．．．．

② 混合蛋白质的盐析：

● 合适的盐析范围：不同蛋白质盐析峰会重叠，权衡回收率和纯度；盐析沉淀最适合

沉淀分级范围是8%（收率90%），盐析范围宽，回收率高，但是纯度降低；

● 改变浓度：如果沉淀峰重叠，可以适当稀释；

● 二次盐析： 分步盐析

总之，蛋白质盐析操作有两种方法：一是固定蛋白质溶液的PH 值和温度，变动离子强度达到沉淀的目的，称为k 盐析；二是在一定的离子强度下，变动PH 值和温度达到沉淀的目的，称为β盐析。K s 盐析共沉作用大，影响分辨率，因此多用于前期，后期多用β盐析。

中性盐进行分离时，有三种情况:一是目的物在相对狭窄的浓度范围内沉淀，有很大的比活性；二是较宽的含有杂质的沉淀；三是某组分高度可溶，除去杂质，目的物留在上清液。

盐析一般在纯化方案的初始阶段，后期目的物浓度降低不合适盐析操作了。

2）盐析操作要点：

① 盐的种类选择：盐析作用强、溶解度大、生物惰性、来源经济、缓冲强。磷酸盐贵 中性盐有(NH4) 2SO 4、Na 2SO 4、MgSO 4、NaCl 、柠檬酸钠等。一般，半径大单价盐效果差，半径小多价盐效果好；阴离子比阳离子效果好。离子主要排序如下：

柠檬酸根>酒石酸根>磷酸根>F->SO42->Cl—>次氯酸根>Br—>NO3>I—；

Al 3+>H+>Ba2+>Ca2+>Mg2+>Rb+>NH4+>钾>钠离子>锂离子；

(NH4) 2SO 4、Na 2SO 4温度影响小、价廉；二是只能在PH

② 盐析范围的确定：从下表中可以看出要选择是纯化倍数还是回收率，饱和度在45-70%回收率可达到94%。综合考虑。

③ 盐的加入方式：使用时必须看清表上的规定温度。

● 固体盐加入要分次缓慢加入（均匀），防止产生泡沫和过热，达到溶解平衡再继续加入。 ● 如果加入液体，常用饱和度来表征硫酸铵：25℃饱和度为4.1mol/L（100%）。有表

X=G(P2-P1)/(1-AP2) X 是1L 溶液需要硫酸铵的质量；P1\P2是初始和最终溶液的饱和度，%；G 是经验常数，25℃为513，0℃为515；A 是常数，0℃为0.27，20℃为0.29。

④蛋白质浓度：不要太稀，也不要太高，防止共沉，不同浓度的蛋白质所要求的临界盐浓度不同，蛋白含量最好控制在2-3%；PH 值最好在等电点；温度，高盐下温度越高，溶解度越低。注意蛋白质沉淀后在4℃放3个小时以上或过夜，形成较大的沉淀。

其他方法还有反渗透法和反抽提法

1.2 处理过程

浓缩：将上一步的清液中转到浓缩罐，进入超滤器浓缩，P ：0.1MPa ；弃液蛋白含量5mg/ml。当蛋白含量达到50-60mg/ml浓缩完成，转到盐析罐；

盐析：

2、有机溶剂沉淀法：

蛋白质、核酸等物质加入亲水性有机溶剂，它们的溶解度显著降低，并沉淀出来的方法。 ．．．

1）基本原理：沉淀机理主要有两个方面：一是静电作用：有机溶剂加入会降低介电常数，从而增加了蛋白质等粒子间的引力，发生吸引沉淀（F=q1q 2/εd2）；二是脱水作用：亲水的有机溶剂加入后，争夺蛋白质等表面水分子，使其碰撞沉淀。

相比：。

2）沉淀条件讨论：

① 温度：高温会引起变性，防止有机溶剂溶于水放热，要预先降低有机溶剂的温度-20，

必要降低有机溶剂的浓度；

② PH 值：等电点溶解度最低，且大多数蛋白质带有相同电荷；

③ 蛋白质浓度：最好在0.5-3%之间；

④ 离子强度：越高，需要的有机溶剂浓度也越大，离子强度在0.01-0.05molL ；；

⑤ 有机溶剂的选择：需要考虑介电常数小、沉淀强；对生物分子变性作用小；毒性小；

能与水无限互溶。乙醇应用最多。

⑥ 多价阳离子：可以降低蛋白质在有机溶剂中溶解度，但要避免与磷酸根溶液。 ⑦ 溶液用量：V=V0(S2-S1)/(S0-S2)

3、等电点沉淀法

1）原理：偏离等电点，所带电荷要么正要么负，分子之间有排斥作用，只有在等电点引力最大，最有可能沉淀，因此在该点沉淀出来的就是等电点沉淀。

蛋白质分子分布了很多极性基团，结合水分子形成水化层，在等电点并不一定沉淀，只

有破坏水化层才可能发生沉淀。此方法一般配合其他方法一起使用，如盐析法。

2）沉淀条件讨论：

与其他方法共用；离子强度要综合考虑；溶质表面极性的影响。

4、非离子多聚物沉淀法 、PVP 、葡聚糖都可以用于沉淀蛋白

分离大分子和微粒一般有两种方法：一是选用两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统，使生物大分子因不同的分配系数而不等量分配，再加上PH 、温度、离子强度以增强效果（实际是萃取）；二是用一种水溶性非离子多聚物，生物大分子在单一相中被排斥而沉淀析出（先出去大颗粒）。

1）原理：主要基于体积不相容性。PEG 分子在溶剂中排斥蛋白质，可能发生共沉，可能产生复合物沉淀。 医药级PEG 尽量选择低分子量的，并且多用于病毒和细菌。

2）影响因素：盐浓度越高，需PEG 浓度越低；PH 值一定是在等电点附近需PEG 越低。PEG 的相对分子质量相对较高要好些（6000）。

5、选择性变性沉淀：

1）原理：有些被分离物质能忍受剧烈条件，杂质却因为不稳定而变性沉淀。

2）变性沉淀的种类：：需要注意温度升高使酶活升高，被分离物有被水解的风险，因此最好在硫酸铵中进行；二是除了合适PH 值、温度外，也要考虑保温时间b 、：可靠、快速，要全面了解分离物和被分离物的性质。。

6、复合盐沉淀法： 有：物分子碱性功能团作用的有机酸复合盐法（无机酸与乙醚萃取）、无极复合盐法。

能与酶形成复合物沉淀的是酶（蛋白质）沉淀剂，常用单宁、聚丙烯酸高分子聚合物

7、亲和沉淀： 是利用专一性。一次作用亲和沉淀仅用于多价、特别是4价以上的蛋白质，多配基和多价蛋白质发生交联而沉淀（沉淀条件不好掌握）；二次作用亲和沉淀：是亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使溶解度下降，如可逆沉淀性聚合物（SIS ）。

8、大规模沉析过程：

1）初步混合：混合时间t=l/4D 2；l 是末级端流混合长度，D 是扩散系数。末极端流是各向同性的，l=（ρμ3/P/V）1/4，ρ是溶液密度，u 为黏度，P/V是单位体积输出功率。

2）起晶：生物体系瞬间完成

3）扩散控制晶体生长：涉及分子量的计算；

4）对流沉析： 5) 絮凝阶段。

附 三章：过滤

第五章、凝胶层析 凝胶是具有多孔网状结构的分子筛，对大小、形状不同的分子进行层析。

凝胶过滤层析（GF 也有称之为排阻层析），是按分子大小进行分离的手段。1959年交联葡聚糖凝胶诞生，它是有线性葡聚糖分子经过氯醇交联而成，增加了机械稳定性，根据交联程度限定了分级范围。

凝胶层析的优势：1）凝胶介质不带电荷，良好的稳定性，分离条件温和，回收率高，重现性好；2）一般情况下，小分子、离子、去污剂、表面活性剂对分离不产生影响，能在不同的PH 值、温度下进行；3）应用范围广；4）设备简单、介质可反复使用。

一、原理

三维网状结构的介质存在大量间隙，只有小分子由于扩散作用可以通过颗粒介质的内部而被滞留，大分子被排阻在颗粒外部，在颗粒间迅速通过。

1）影响因素：凝胶技术是按分子大小进行分离的，与M 直接相关，每一种凝胶介质都有特定的分子量分级范围（凝胶介质的主要参数）。根据分级范围，把溶质分子分为三种：一是大于分级上线的全排阻分子，从颗粒间通过，流程最短，首先从层析柱中出来；一是小于分级下线的全渗透分子，流程最长，最后出来；在分级范围内的是部分渗透分子，它们不同程度的进入凝胶颗粒内部，是凝胶介质有效分离的对象。如果两种物质的分子量都大于上线或都小于下线，则无法分离。

影响洗脱快慢的不仅仅是分子量，还有分子的形状，对称性高的则容易进入凝胶内部，．．．．．．．．．．．

洗脱时间长。

2）分级分离的两种类型： 一是分子量极为悬殊的两类物质分开，称为类分离或组分离； 另一类是分子量相差不大的大分子物质加以分离，叫做分级分离。

3）有关理论的问题：

● 凝胶柱的体积参数：总柱床体积V=凝胶体积Vg+外水体积V0+内水体积Vi ； 柱体积是

从柱底板到凝胶沉积表面的体积。

● 洗脱体积及分配系数：在凝胶柱洗脱时因保留时间不同而分离，度时，通常采用洗脱体积Ve ，定义为从样品加入开始到洗脱组分达到最大浓度时流出洗脱液的体积（洗脱峰）。柱下端一般与检测器（UV ）相连。全排阻分子的洗脱体积Ve=V0，全渗透分子的洗脱体积Ve=V0+Vi。凝胶层析存在一个分配系数Kd ，Ve=V0+Kd·Vi 。Kd>1的情况，如疏水作用、亲和作用和静电作用使洗脱变后。Kd 的测定V 0可以用蓝葡聚糖2000（二百万），根据上式变化求出，内水体积测定干胶质量乘以单位凝胶吸水量，但是Vi 的测定还有不确定性。

● 分辨率：Rs=2(Ve2-V e1)/（W b1+Wb2） V2/V1是峰1、2的洗脱体积；W 是两峰的峰宽。决定着两种的因素包括组分的分子大小，凝胶柱的选择性和柱效。

选择性：用相对保留值α来表示：α=（V2-V0）/（V1-V0）；

选择性是系统分离不同组分的能力，好坏取决于凝胶的特性。

柱效：理论塔数N 是每米层析床所包含的理论塔板数：N=5.54（V e /Wh ）2；V 是洗脱体积，W 是洗脱峰半峰高的宽度。还可以用理论塔高度H 表示：H=L/N。较长的柱，细的介质。

二、凝胶过滤介质

1）必须满足的条件：较强的机械的稳定性、高化学稳定性（方便清洗和消毒）、球形均匀呈现亲水性、不带电荷。

2）凝胶过滤介质参数和性质：

● 粒度：指溶胀后凝胶水化颗粒的大小，用水化颗粒的直径来表示（um ），也有用干颗粒直径表示的。用于层析的一般在5-400um 的范围内，关系到分离效果。粒度越小，层析柱理论塔板数就越大，分离效果就越好，但是分离样品就越少，层析过程压力增大，限制流速的提高，对设备要求也高，因此细颗粒适用于分析型分离；颗粒大些分离样品量大些，使用于中小规模的制备型分离。除此，颗粒均一性也影响分离效果。

● 交联度和网孔结构：网孔结构式通过交联剂将相邻的线性分子链接而成（琼脂糖sepharase 除外）。交联度决定了凝胶的分级范围，因此也有不同的分级范围的凝胶如sephadex G10 G15……

● 多孔性取决于Vi/（Vi+Vg），凝胶颗粒的渗透性定义为凝胶柱内体积与外内水体积之比。得水值又叫吸水值、膨胀度，定义为每克干胶吸附水的体积，单位为ml/g。

● 机械强度：层析操作中，层析柱承受的压力降和所采用的流速规定了介质必须具备一定的强度。

● 物理和化学稳定性：物理稳定性主要是承受高温高压的情况。比如灭菌，物理性能好的采用高压，否则采用化学灭菌法。此外，介质填充层析柱后，对操作稳定也有一定的要求，超出温度范围对柱效产生影响，这种情况下要重新填充

● 化学稳定性：PH 值稳定，用酸用碱是清洗凝胶的常用手段，要求极端PH 下具有短程稳定性而不被降解。

3）凝胶过滤介质的种类：

按基质组成可以分为葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、二氧化硅以及混合凝胶，按凝胶层析达到的柱效和分辨率可以分为标准和高效介质凝胶，前者特点是颗粒较大，典型的为100-250um ，后者为二氧化硅和高交联琼脂糖的介质，特点颗粒小，典型为5-50um ，机械强度相对较高，柱效高，价格贵。

① 葡聚糖凝胶：sephadex 称为葡聚糖凝胶，由安玛西亚公司生产。葡聚糖又称右旋糖酐，合成sephadex 有一系列不同型号，表示为sephadex G加个数字，数字越小，交联越大，分级范围越小，G200交联度最小。G 后面数值相同情况下，凝胶颗粒又可以分为粗、中、细、超细不同规格，颗粒越细，操作压力也越大。数字越大，网孔越大，适用于高分子。

葡聚糖中含有大量的羟基，有较强的吸水性，G 后面的数值粗略的表示了10g 干胶的得水值（ml ）。溶胀时，沸水脱气，避免剧烈搅拌，防止凝胶颗粒破裂，交联度越低，溶胀时间越长。G 系列凝胶机械强度不大，不能承受高压和高流速，较高的操作压导致柱床压缩，甚至凝胶颗粒劈裂，必须严格控制流速。常用碱性液清洗，使用时避免氧化剂将羟基氧化成羧基

② 琼脂糖凝胶：agarose ，中性分子，琼脂糖在无交联剂的情况下也会形成凝胶，单个的链状分子之间形成双螺旋结构，进一步形成束装，维持力是氢键。

● sepharose ：不交联

柱状的琼脂糖凝胶商品名sepharose ，由安玛西亚公司生产，根据琼脂糖含量不同，有三种型号（2B/4B/6B “阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量”）。化学稳定性尚可，PH4-9下无氧化剂下稳定。Sepharose 温度范围较窄，0-40℃，低于0度，遭受不可逆的破坏，高于。Sepharose 机械强度低，相比，6B 大于2B 。sepharose 分级范围很宽，适用于分离分子量差异很大，对分辨率要求不高的产品。

Sepharose 。含有少量的硫酸基和羧基，对正电荷产生吸附，如果洗脱剂离子强度大于0.15可以避免这种吸附。 做成凝胶后不再脱水干燥，否则不能回复原有形状。

● sepharose CL：

CL 表示交联。 sepharose 靠氢键来维持，强度和稳定性不是很理想, 用2,3二溴丙醇交联，PH 稳定范围、机械强度、稳定性都有很大的提高，能够在121℃反复高压灭菌，但是要避免氧化剂。

● superose ： 目前最好的

安玛西亚公司生产高分辨率、高机械强度、分级范围宽的新型凝胶介质，在柱状琼脂糖颗粒上两次交联得到。分为sepharose 6 和sepharose 12 两类，每类又分为普通级和制备级，制备级颗粒要粗些。Sepharose 机械强度好，适合于高速分离过程，同样洗脱剂离子强度要大于0.15。Sepharose 4 and 6 Fast Flow乃高度偶联的琼脂醣介质，流速特快。

● Bio-Gel A A 是数字如0.5M ，数字乘以106表示排阻限度。

Bio-Gel A系列由伯乐公司开发，与separose 结构相同，但是温度稳定性差（2-30℃）。产品还有法国IBF 公司、美国、英国系列、丹麦系列、中国产．．．．．．．．．．superAgogel ．．．．．．．．．．．．．．Sagavac ．．．．．．．．．．．．Gelarose ．．．．．．．．．．．．．．QT 系列。 ．．．．

③ 丙烯酰胺凝胶：

目前最常见的是伯乐公司生产的Bio-Gel P系列凝胶，分为7个型号，P 后面数值越大（数字乘以1000相当于排阻限度），交联度越小，粒径不同的规格。与G 系列接近，但是稳定性不如sepharose G系列，强酸强碱容易水解。

④ 复合结构凝胶：

● sephacryl HR：烯丙基葡聚糖+Bis。颗粒尺寸分布窄、低流速可以获得很高的分辨率，机械、理化性能都优于传统凝胶介质。优于机械强度高，可以承受高的背景压力，适用于高流速快速分离；PH 稳定性好，可以用0.5mol/L的NaOH 清洗。

● superdex ：安玛西亚公司生产，是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一（100-7000）。Superdex 是葡聚糖和高度交联的琼脂糖颗粒共价结合的复合型凝胶。琼脂糖决定了高度理化稳定性，Ph 0-14都可以工作，葡聚糖链决定了凝胶的层析性能。

可以承受很高的流速，可以高压灭菌。填充好的superdex 层析柱使用温度为4-40度，超出温度会破坏柱效，必须重新装柱。清洗方案是0.5mol/L的盐酸和氢氧化钠。 ● ACA 系列凝胶是琼脂糖和聚丙烯酰胺混合型凝胶介质。

⑤ 其他类型的凝胶。

四、试验方案设计 需要注意一下几点：

1、凝胶过滤介质的选择：

1）分离目标和凝胶过滤介质的特性：生化分离过程有分离。分析型分离的样少，用于分子纯度的测定，分子量的测定和分布；制备型样品较多。

同一交联度型号又分为多种规格，如粗、中、细、超细。脱峰窄，分辨率也越高，但背景压力高，价格也贵。一般情况，粗规格适合于数量较多的样品分离；中规格适合于少量样品的制备，常规分析测定；超细规格凝胶适合微量样品分析。 在大规模工业生产中，对分辨率要求往往退居其次，而对生产能力、分离时间和分离成．．．．．．．．．．．．．本的要求较高，此时应当选用颗粒较粗、机械强度较大，易于清洗和重复使用的凝胶介质。 ．．．．．．

2）选择性曲线和分离范围

待分离物质的分子大小是决定选用何种介质重要的因素，要在凝胶的分级范围内。另外，凝胶介质的选择性曲线对于指导凝胶的选择很有帮助。每种介质的选择都有针对球形蛋白和针对线性葡萄糖两种，应该根据目标分子的形状更接近哪一种来确定选择性曲线。

3）样品和洗脱剂特性：除上述之外，目标分子的种类和凝胶的选择也有重要关联。 洗脱剂可以选择温和的，不会对介质产生不良影响的。但是有时可能含有不良的组分导致层析样品失活甚至在柱中沉淀的现象。

2、洗脱剂的选择

理论上讲，如果分离物质不带电，可以直接用蒸馏水洗脱，然而一般都采用缓冲液。缓冲液首先要考虑PH 值，一般在中性附近，采用的缓冲物质解离常数PKa 接近这个PH 值，使用最多的是磷酸缓冲液（PKa7.2）和Tris （8.1）缓冲液。

凝胶介质多少带有些负电荷，会影响过滤结果，离子强度的增加会减少溶质间的离子作用，一般用满足0.15mol/L的离子强度。NaCl 是最常使用的盐类，缺点是有点腐蚀能力。凝胶层析如果发生在纯化方案末期，在冻干之前，需要盐析掉缓冲液，而且宜采用挥发性高的缓冲液。 抑菌剂叠氮钠。

3、层析柱的选择：

特点：积的0.1%；合理的凝胶床支持物，不易被堵塞；拆卸容易，方便清洗。当然有机溶剂、极端PH 值和背景压力也要考虑。

尺寸常用内径和高度（mm ）来表示，可以计算出柱体积和高径比。分辨率Rs 与柱长的

平方根呈比例，分析型分离要求分辨率高，采用柱长的，不过很少超过1m 。

4、预装柱：为了获得高分辨率，一些公司将介质装成预装柱。

五、层析技术

设计完成后，选择好的凝胶介质、层析柱、洗脱剂、样品，进行装柱、平衡、加样、洗脱、样品检测、层析柱清洗（氯化钠）、再生，都是层析技术。

1、凝胶的准备

如果不是预装柱，则自行装柱，但依是否溶胀还有不同。市售溶胀好的，一般不需要处理，清去上清液，按湿胶：洗脱剂=3:1的比例添加洗脱剂，搅匀装柱；如果是干胶，用水溶胀，干胶用量=体积/膨胀率。

2、装柱

装柱对任何层析都很重要，填充不好会导致流速不均匀，区带扩散，对层析流速产生影响。市售层析柱有两种：一是传统的，接头位置固定的，另一类是接头可移动的，凝胶床上不要留有水柱。装柱不能有界面，可用蓝葡聚糖2000测定。

3、样品和洗脱剂的准备

高分辨率介质或预装柱时，配置洗脱剂须是分析纯的，过滤的。滤膜口径1um ；小于90um 的使用0.45um 的孔径，甚至是0.22的。

样品的黏度也是影响上样量和分离效果的因素，为了避免粘性手指效应，样品黏度和洗脱剂黏度之比应小于1.5.

4、加样：

1）加样量：因为分辨率Rs 与样品体积/柱体积有关，该比值增大，分辨率下降；分析型分离和难度较大的分离，对分辨率要求较高，因此加样体积在0.5-5%；在脱盐、缓冲液组别分离时，加样可以达到柱体积的30%，如果需要很高的回收率，比例须减少到15-20%。

加样是将一定溶液均匀加到床面，床面有一段水柱，防止破坏床面平整性，使洗脱峰变宽。

5、洗脱技术

恒定流速一般靠静水压（软胶）和泵来控制（当然也受柱的材料、尺寸、连接方式、泵的种类和介质的机械强度影响）。生产效率尽可能的要求流速大，但分辨率会下降。

6、检测

7、介质过滤与再生：用氢氧化钠（清洗堵塞、杂质）和氯化钠清洗一个柱体积。葡聚糖和琼脂糖介质还要加入一些抑菌剂。

六、应用：脱盐、缓冲液置换、相对分子质量测定、混合物分级分离。

第八章 蒸馏和精馏

按操作流程分有（大规模）；

按蒸馏方式有简单蒸馏、平衡蒸馏（闪蒸）、精馏和特殊精馏（较难分离）；膜蒸馏。 按操作压力分为常压、加压和减压蒸馏，热敏性和沸点高可以采用减压蒸馏。

一、蒸馏原理

1、双组份平衡原理

1）相律：F=C-Φ+2 F 是自由度，C 是相数，Φ是独立组分数，2是只有压力和温度两个条件。

溶液蒸汽压：一定温度下，气液达到平衡，液面上蒸汽压强就是该组分蒸汽压，如果有两个组分，则两个组分的分压都小于纯组分的蒸汽压P A

道尔顿分压定律：y A =PA /P,P=PA +PB , y是气相组分的摩尔分数。

2）拉乌尔定律：P A =PA0x A ，P B =PB0(1-xA ) ，x 表示液相中易挥发组分的摩尔分数，y 表示气相中易挥发组分的摩尔分数； x=（P-P B0）/(PA0-P B0),y=PA0/P 。以上均以理想溶液。

3）挥发度：是指在一定温度下的饱和蒸汽压，两组分的挥发度v A =PA0。

相对挥发度：两组分的挥发度之比，α=vA /vB =（P A /xA ）/（P B /XB )= yA x B /yB x A 。

一般可将α视为常数，气液平衡方程：y=αx/1+（α-1）x 。α>1或者值越大，分离愈容易，α=1时，普通蒸馏就无法分离了。 。

4）双组份非理想溶液： a 、正偏差溶液：混合液间的吸引力小于纯溶液时，混合后溶液更容易气化，从而导致蒸汽压变大，这种混合液称为与理想溶液发生正偏差的溶液。

b 、负偏差溶液：混合液分子间吸引力大于单纯组分的吸引力。如硝酸-水、氯仿-丙醇。

第十二章：离心技术

密度差较小，颗粒较细，用离心沉降技术大大提高沉降速率。是一种利用离心力、颗粒物质的沉降系数、质量、浮力因子的差别进行分离、浓缩和提纯的方法。局限性是不能分离颗粒大小一样、密度一样的颗粒。

一、离心设备：

1、离心机：有工业级和实验室级；转速有低速（10000r/min以下）、中速（25000）、超速； 主机主要有驱动系统、真空、恒温、控制、润滑系统，部分由光学测试系统。

驱动系统多是变频电动机，冷却电动机的方式为水冷或风冷；为了防止驱动轴爆炸，要求驱动轴一定的区带弯曲，离心管中同密度样液质量不差过0.1g 。真空系统：低速离心机可以用冷冻机制冷；超速离心机使用油旋转真空泵加上油扩散真空泵，因此对于密封要求也很高。控制系统主要控制速度、温度、真空度等。

在跨音速去以下，空气扰动小，高速离心机（20000左右）宜收集碎片、细胞器等。

2、转子：转子一般由钛合金和铝合金制备，子。离心室为了防止转子爆炸有钢柱和安全门保护，对材料、平衡等有很高的要求。 选择转子的要求：额定转速、容量、形状、使用寿命。

3、离心管：管体的管口有光口和螺口两种，一般都有管盖。通常有玻璃、塑料和金属（不易观察）制成。离心管选用：容量、离心强度、转速、耐腐蚀性。

二、基本原理：

1、相对离心力：离心加速度a=v2/r ； 离心力F=ma ； v=rω； ——① 由转速表示： 22 与质量、半径、转速相关 ——②

相对离心力是物质受到离心力与重力之比：RCF=ω2r/g=1.118×10-3n 2r ——③ 离心力习惯上用相对离心力和g 的乘积来表示，例如5000g 。

2、沉降速度：参考斯托克斯公式；沉降速率v=d2（（δ-ρ）/18u）ω2r ； ——① 在重力场中将ω2r 换成g ，称为自由沉降速率。

3、沉降系数： s= d2（（δ-ρ）/18u） v=sω2r ——②

可以看出，物质颗粒的大小和性质、液体粘度、颗粒密度都与离心沉降有关。s 值一般很小，一个单位为10-13。

4、离心时间和K 因子

5分子质量的计算

四：超离心技术：

有差速离心法、密度梯度区带离心法

五、符合GMP 的离心机

GMP 规范：防止微生物；接触表面不与被分离材料反应；内表面抛光，转角圆弧；离心机有就地清洗的条件；离心机外壳开启有多种方式，以充分检查；防静电；蒸汽压力进行灭菌；具备辅助检测功能；物料工艺区与传动部分分离开（穿墙设计）。

GMP 要求设备设计主要考虑：基础设计、滤饼自动清除、离心篮设计、污染免除设计。

六、离心设备：工业分离机分为过滤离心机、沉降离心机和离心机三类。

三足式离心机、管式分离机、碟片式分离机、连续流分离