组织培养论文
草莓转基因研究进展
摘要:草莓是世界上重要的水果之一。现代生物技术的不断发展为草莓育种和种质创新提供了新的技术手段, 它可以直接将来自不同种属的异源目的基因插入到草莓基因组, 使草莓表达目标性状,实现草莓品种的遗传改良。近年来, 国内外草莓转基因研究在抗虫、抗除草剂、抗逆及品质改良等方面的取得了新进展。本文主要分析草莓转基因研究中存在的主要问题, 并对今后的研究方向和应用前景进行了讨论。
关键词:草莓 转基因 再生植株 种质改良
草莓是一种经济价值较高的多年生草本植物, 因此需要引进新的手段和方法进行育种。生物技术的发展为现代育种开辟了新途径, 它有目的、有计划地向草莓引入优良性状而不改变它原有的其他特性, 使草莓品种改良具有定向性和预见性, 获得常规育种难以或无法得到的新类型, 从而创造出新种质。从已有研究结果看, 进展较为迅速, 目前已经获得了抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂和品质改良等方面的转基因植株, 并进行了田间试验。
1、草莓遗传转化体系的建立
最初用于草莓遗传转化研究的主要是 gus、npt II和 hpt等报告基因, 目的在于探讨影响遗传转化的各种因素, 建立起有效的遗传转化体系。根癌农杆菌介导法是草莓遗传转化的重要方法, 它是以草莓的叶片、叶柄和愈伤组织等为外植体, 经农杆菌浸染后, 通过抗生素筛选、器官发生获得再生植株。1990年,用农杆菌介导法将 gus和 npt II基因导入草莓, 分别得到3%和6.5%的转化率。El-Mansouri等[1]用农杆菌 LBA4404将含 nos/npt II基因导入草莓, 经过10周在含 25 mg/L卡那霉素 (Kan)的培养上筛选, 获得了6.9%的转化率, 再生芽能在含 25 mg/L Kan的生根培养基中生根, 并成功移栽到大田中。Mathews等[2]在前人研究的基础上, 采用了逐步提高筛选择压力和保持选择压力不变两种方法继代转基因芽, 经 gus组织染色、PCR和 Southern检测表明, 逐步提高选择压力没有嵌合体的产生, 为今后进行转基因研究提供了一种新的思路。美国的 Oosumi等[3]把森林草莓种子萌发生长 6~7 周后, 以未展开的三小叶为材料, 用农杆菌介导法将潮霉素磷酸转移酶基因 hpt导入草莓, 获得了100%的转化率, 为导入有经济价值的目的基因奠定了坚实的基础。随着农杆菌介导的草莓叶盘转化法的日臻完善, 国内外的研究者开始把研究重点集中到本国或地区的某一主栽品种, 在建立高效、稳定再生体系的基础上, 将抗虫、抗病毒、抗逆、抗除草剂和
改良果实品质等目的基因导入草莓, 以期改良现有草莓品种性状。
2抗虫害转基因研究
虫害给草莓生产造成严重损失, 化学药剂杀虫不仅成本高, 且会污染环境; 而安全低毒的生物杀虫剂也存在成本高、药性不稳定等缺点。利用转基因技术把抗虫基因导入草莓, 培育抗虫新品种, 是综合防治草莓害虫的理想手段。目前在草莓中应用的抗虫基因主要是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (CpTi)。1992年, James等[4]首先开展了草莓抗虫转基因研究, 他们将与几种鳞翅目和鞘翅目害虫抗性有关的 CpTi基因转入草莓品种“Raoella”中, 获得了转基因植株。藤象甲幼虫饲喂试验结果表明, 在转基因植株上幼虫的成活率为 80%~90%。接着, Graham等[5]将 CpTi基因导入草莓, 在温室中对其进行生物学检测表明转化植株在第三年仍能有效的减少大田中藤象甲及其虫蛹造成的损失, 与对照相比, 转基因草莓的生长明显得到改进, 藤象甲的数量大大减少。 3年的田间试验进一步证实了温室的试验结果, 转基因植株藤象甲虫蛹明显减少, 而对步行虫和其他非目标节肢动物无显著影响。
3抗逆性转基因研究
目前, 抗逆基因工程主要集中在逆境条件下才能表达的某些基因和抗逆代谢过程中某些酶的研究, 现已分离出许多与抗逆代谢相关的基因, 如与抗盐碱有关的脯氨酸合成酶 (ProA)、甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)、磷酸甘露醇脱氢酶 (mtl)和磷酸山梨醇脱氢酶 (gutD)等基因;与抗冻害有关的抗冻冷诱导转录影响因子基因(CBF1)和抗冻蛋白基因 (AFP)等。草莓抗盐基因工程研究进展较为迅速, 已克隆了 ProA、BADH、mtlD等与耐盐相关的基因。1997年, 刘凤华等 [6]用农杆菌介导法将 35S启动子调控的 BADH基因转人草莓, 得到了能耐 0.4~0.7% NaCl的转基因植株。经检测 , 转基因植株中该基因的转录水平、BADH活性及耐盐性均明显高于对照。1999年, Firsov和 Dolgov[7]农杆菌介导法将AFP基因导入草莓, 获得了转基因草莓植株, 但未见有关其农艺性状方面的研究报道。随后, Owens等[8, 9]从草莓和酸樱桃中克隆出与拟南芥同源性很高的冷诱导转录影响因子 CBF1基因, 将其置于35S启动子的调控之下, 通过农杆菌介导法导入草莓“Honeoye”,获得两株转化植株。检测表明, 该基因在转化植株的叶片和花托中仅有较低水平的表达量, 但转化株系叶片的相对电导率在温度降低至 8.2℃和10.3℃时, 仍没有明显变化;而未转化的野生型株系在 6.4℃已有了很大改变, 表明转基因植株的抗寒能力增强。
4抗除草剂转基因研究
杂草常常给草莓生产者造成重大损失, 而人工除草是一项非常费时而效率低的劳动。草莓的绝大多数品种不抗除草剂, 所以把抗除草剂基因转入草莓, 其意义十分重大。 1997年, Hennie等[10]通过农杆菌介导法将编码的草丁膦乙酰转移酶基因 (PAT)转入草莓品种 “Selekta”中。在温室内, 转基因植株增殖正常, 表型与对照相似。除草剂喷施 3次后, 转基因植株生长正常, 而未转化的对照植株在 3周后死亡。2001年, 张志宏等 [11]在建立草莓主栽品种高效、稳定的离体再生体系的基础上, 利用携带有 gus报告基因和 bar基因的农杆菌EHA105浸染草莓品种“vǔguea”叶片, 转化芽再生频率达 6.8%。随机选取的 10个 gus基因转化植株进行基因表达测定, 结果 5个植株强烈表达 gus活性。转 bar基因植株在附加 10 mg/L草丁膦的培养基上能够正常分化, 而对照植株继代在培养 1个月后死亡。在温室内, 转 bar基因植株对草丁膦表现出完全抗性。在 1999~2000年的两年间, 转基因植株正常开花结果, 其他生物学性状也表现正常。Morgan等[12]则将编码 CP4.EPSP的草甘膦合成酶基因通过农杆菌介导法导入草莓“Camarosa”中, 获得了73株抗除草剂的独立转化植株, 部分转基因植株对草甘膦表现出完全抗性。抗除草剂转基因草莓植株的获得为草莓基因工程的实用化奠定了基础。
5提高草莓品质转基因研究
草莓是小浆果, 保鲜期短, 仅能置于冰箱保鲜 1~2天。各国学者在如何延迟草莓果实成熟、改善草莓储运性、改良果实品质等方面做了大量的研究。果实内碳水化合物的组成及平衡在果实风味和加工品质中起重要作用。1997年, Bachelie等[13]将来自源于马铃薯编码细胞壁和液泡的转化酶基因导入草莓中。果实品质检测表明, 转基因草莓果实的风味、糖份组成和加工品质发生了改变。果胶酶是分解果胶酶的通称, 它在果实成熟过程起着十分重要的作用。2002年, Jiménez-Bermudez等[14]将35S启动子调控的反义表达果胶裂解酶基因导入草莓基因组中。与对照相比, 转基因植株果实相对较硬, 而果实颜色、大小、形状和重量都无明显的变化;同时, 果胶裂解酶基因表达量比未转化植株低 30%。转基因果实由白变红的过程中, 其硬度降低要比未转化植株慢;在果实的后熟过程中其软化也明显减缓。这些研究结果表明, 果胶裂解在果实成熟过程起着十分重要的作用, 为研究草莓软化的机理奠定了基础。此外, 提高草莓果实产量, 改变植株性状方面的研究也取得了一定的进展。生长素对草莓果实的生长发育及其基因表达具有重要的调控作用。 Mezzetti[15]将胚珠特异表达的生长素合成酶基因 DefH9-iaaM导入草莓栽培品种和野生草莓,果实大小、单株坐果数及产量都显
著增加,果实增大 20%~100%, 其中栽培品种的产量增加了 180%, 野生草莓增加了140%,而果实的总糖含量无明显的变化。
6存在的问题和建议
通过基因工程方法将外源基因导入草莓是增强其抗虫、抗逆境、抗病毒能力 , 提高草莓产量和果实品质的有效手段。虽然草莓转基因工程取得了巨大的进展 , 但仍存在着许多问题。主要表现在 : (1) 转化效率低。草莓遗传转化主要采用农杆菌介导法, 而基因型是影响农杆菌转化率的一个重要因素, 草莓不同品种间的转化率差异很大。因此, 在今后的研究中应扩大草莓再生的基因型范围, 选用容易再生的基因型为材料进行遗传转化, 建立起高效、稳定的遗传转化体系。 (2)缺乏有重要应用价值的目的基因。由于草莓多倍性, 遗传背景复杂, 重要性状常受多基因控制, 不易分离到有价的目的基因。目前草莓转基因研究涉及的目的基因不多, 所应用的外源基因很少来自草莓基因组本身。今后应除加强转基因本身的研究外, 还应加快草莓新基因鉴定和分离克隆方面的研究。 (3)目的基因的表达强度不够。目前, 草莓转基因所用的启动子主要是花椰菜病毒 (CaMV)35S的组成性启动子, 它驱动外源基因在草莓体内各部位平均表达, 难以达到理想的效果。至今, 虽然获得了抗病、抗逆、抗除草剂和抗虫以及品质改良的转基因草莓植株, 但由于目的基因的表达强度不够, 还没达到在生产上推广和应用的要求。以后应从选择特异表达或诱导型的启动子、构建含 MARs的表达载体、利用引导肽进行表达产物的定位及建立位点特异的重组体系等方面加以改进, 以尽可能地提高目的基因的在转基因草莓中的表达强度和效率。
总而言之, 随着研究手段的不断更新和改进, 以及细胞生物学、分子生物学等理论与技术的发展, 一定有可能解决上述问题。未来的草莓转基因新品种可能是集抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、优质等为一体的综合性状。
参考文献
[1] El-Mansouri I, Mercado JA, Valpuesta V, López-Aranda JM, Pliego-Alfaro FP, Quesada MA. Shoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of Fragaria vesca L. Plant Cell Rep, 1996, 15(8): 642―646.
[2] Mathews H, Dewey V, Wagoner W, Bestwick RK. Molecular and cellular evidence of chimaeric tissues in primary transgenic and elimination of chimaerism through improved selection protocols. Transgenic Research, 1998, 7(2): 123―129.
[3] Oosumi T, Gruszewski HA, Blischak LA, Baxter AJ, Wadl PA, Shuman JL, Veilleux RE, Shulaev V. High-efficiency transformation of the diploid strawberry (Fragaria vesca) for
functional genomics. Planta, 2006, 223(6): 1219― 1230.
[4] James DJ, Passey AJ, Esterbrook MA, Solomon MG, Barbara DJ. Progress in the introduction of transgenes for pest resistance in apples and strawberry. Phytoparasitica, 1992, 20 (Suppl.): 83―87.
[5] Graham J, McNicol RJ, Grieg K. Towards genetic based insert resistance in strawberry using the Cowpea trypin inhibitor gene. Ann Appl Bio, 1995, 127(1): 163―173.
[6] LIU Feng-Hua, GUO Yan, GUO Dong-Mei, XIAO Gang, CHEN Zheng-Hua, CHEN Shou-Yi. Salt tolerance of transgenic plants with BADH cDNA. Acta Genetica Sinica, 1997, 24(1): 54―58.刘凤华, 郭岩, 郭东梅, 肖岗, 陈正华, 陈受宜. 转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究
[7] Firsov AP, Dolgov SV. Agrobacterial transformation and transfer of the antifreeze protein gene of winter flounder to the strawberry. Acta Hort, 1999, 484: 581―586.
[8] Owens CL, Thomashow MF, Hancock JF, Iezzoni AF. CBF1 orthologs in sour cherry and strawberry and the heterologous expression of CBF1 in strawberry. J Amer
Soc Hort Sci, 2002, 127(4): 489―494.
[9] Owens CL, Iezzoni AF, Hancock JF. Enhancement of freezing tolerance of strawberry by heterologous expression of CBF1. Acta Hort, 2003, 626: 93―100.
[10] Hennie J, Plessis DU, Brand RJ. Efficient genetic transformation of strawberry (Fragaria ananassa Duch.) cultivar Selekta. Acta Hort, 1997, 447: 289―293.
[11] ZHANG Zhi-Hong, WU Lu-Ping, DAI Hong-Yan, WANG Guo-Ying, ZHAO Tian-Yong, BI Xiao-Ying, DU Guo- Dong. Regeneration and transformation in vitro of the strawberry varieties. Ata Horticulturae Sinica, 2001, 28(3): 189―193.张志宏, 吴禄平, 代红艳, 王国英, 赵天永, 毕晓颖, 杜国栋 草莓主栽品种再生和转化的研究. 园艺学报 , 2001, 28(3): 189―193.
[12] Morgan A, Baker CM, Chu JSF, Lee K, Crandall BA, Jose L. Production of herbicide tolerant strawberry through genetic engineering. Acta Hort, 2002, 567(l1): 113―115.
[13] Bacbelier C, Graham J, Machray G, DuManoir J, Roucou JF, McNicol R J, Davies H. Integration of an invertase gene to control sucrose metabolism in strawberry cultivars. Acta Hort, 1997, 436: 161―163.
[14] Jiménez-Bermúdez S, Redondo-Nevado J, Mu.oz-Blanco J, Caballero JL, López-Aranda JM, Valpuesta V, Pliego-Alfaro F, Quesada MA, Mercado JA. Manipulation of strawberry fruit softening by antisense expression of a pectate lyase gene. Plant Physiol, 2002, 128(2): 751― 759.
[15] Mezzetti B, Landi L, Scortichini L, Rebori A, Spena A, Pandolfini T. Genetic engineering of parthenocarpic fruit development in strawberry. Acta Hort, 2002. 567(1): 101―104.