常用实验方法和所需试剂的配制

（一）Western-blot 实验

1. Western blot主要实验试剂

溴酚蓝（Bromphenol Blue）

丽春红（Ponceau S）

考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue R-250）

吐温-20（Tween-20） β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) 十二烷基硫酸钠（SDS ）

过硫酸铵（APS ）

TEMED

聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液

4×浓缩胶缓冲液

4×浓缩胶缓冲液

甘氨酸

Tris 碱

脱脂奶粉

牛血清白蛋白（BSA ）

硝酸纤维素膜（NC 膜） 蛋白质Marker 和预染 Marker

通用蛋白裂解/提取试剂

BCA 法蛋白定量试剂盒

Bradford 法蛋白定量试剂盒 兔源性抗抗体

辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ECL 超敏发光液

定影液、显影液、X 光胶片曝光盒

其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）

2. Western-blot主要实验试剂的配制方法

（1）10%SDS溶液: SDS粉末1g, 加双蒸水10mL 使其溶解，室温保存。

（2）10%APS：APS 20mg,加双蒸水200μL,混匀，现配现用。

（3）10×电极缓冲液（PH8.3）: SDS粉末10g 、Tris 碱30.4g 、甘氨酸144g ，双蒸水定溶至1000mL ，4℃保存，用时10倍稀释。

（4）考马斯亮蓝固定液：乙醇500mL 、冰醋酸10mL 、双蒸水定溶至1000mL 。

（5）考马斯亮蓝脱色溶液：95%乙醇250mL 、冰醋酸80mL ，双蒸水定溶至1000mL 。

（6）考马斯亮蓝染色溶液：0.29g 考马斯亮蓝, 溶解于250mL 脱色液中，过滤后室温保存。

（7）转移缓冲液：甘氨酸2.93g 、Tris 碱5.812g 、甲醇200mL 、去离子水定溶至1000mL ，4℃保存。

（8）10×TBS 溶液：Nacl87.75g 、Tris 碱12.1g ，用双蒸水溶至1000mL ，4℃保存，用时10倍稀释。

（9）TBST 溶液： 1×TBS 溶液1000mL 、Tween-20溶液1mL ，混匀。

（9）丽春红溶液：100g 丽春红,5mL 冰醋酸，双蒸水定溶至100mL ，室温保存。

（11）5×上样缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.6mL、甘油2.5mL 、10% SDS溶液2mL 、β-巯基乙醇（使用前加）0.5mL 、1%溴酚蓝溶液1mL ，去离子水定溶至10mL ，4℃保存。

（12）12%分离胶：聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL 、4×分离胶缓冲液0.5mL 、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED 原液10μL、双蒸水溶至8mL 。

（13）5%浓缩胶：聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL 、4×浓缩胶贮备液0.25mL 、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED 原液5μL、双蒸水溶至4mL 。

（14）NC 膜封闭液：脱脂奶粉1g ，TBST 溶液20mL 中溶解，4℃保存。

（15）抗体稀释液：TBST 溶液20mL 、小牛血清白蛋白1g ，混匀，4℃保存。

（16）Striping Buffer：β-巯基乙醇 35μL、10%SDS 溶液1mL 、0.5MTris 溶液(pH6.7) 625μL，去离子水定溶至5mL ，室温保存。

3. Western-blot实验步骤

（1）总蛋白的提取 （采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提）

①电子天平精确称取组织50mg （±2mg ），放入含有1mL 细胞裂解液和适量的PMSF （终浓度为1mmoL/mL）的预冷玻璃匀浆器内，冰上匀浆。

②取0.5mL 匀浆液移入新的2mLEP 管内，加1mL 蛋白抽提试剂并混匀，静置

10min 后（偶有颠倒混匀），12000g 4℃离心10min 。

③弃去上清保留蛋白质膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min ，4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。

（2）总蛋白浓度的测定（BCA 法）

①配制统一的蛋白质标准品：以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 的标准品溶液（浓度为1mg/mL）制作蛋白质标准曲线。分别吸取BSA 标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自加入0.01MPBS 溶液补足到2000μL，配成梯度浓度的标准品溶液，分装后-20℃备用。

②配制BCA 工作液：按50：1的比例将BCA 试剂盒内的A 试剂与B 试剂进行混合，配成BCA 工作液。室温保存，1d 内使用。

③样品处理：取各样品10μL，加0.01MPBS 溶液490μL，配成待测样品。

④加样：先于酶标板上样孔内加入200μL BCA 工作液，再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL，酶标仪上震荡3min ，充分混匀。

⑤测定：将酶标板置于恒温水浴箱中，37℃孵育30min 。用MRK3型酶标仪测定562nm 波长下各孔吸光度值（optical density，OD ），采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。

（3）样品浓度的配平和制备

①配平：按测定的各样品蛋白质浓度，用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度。根据预实验结果，将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL。

②制备：将配平后的样品与5×上样缓冲液按4：1的比例混合。 100℃水浴10min ，部分4℃保存用于电泳，部分-20℃保存备用。

（4）样品内蛋白含量的检测

①凝胶的配制：配制12%分离胶和5%浓缩胶（配制方法见附录）。

②上样：分别用Eppendorf 微量移液器吸取蛋白质Marker 或样品各10μL，将枪尖的插入加样孔的底部，缓慢地将样品或Marker 加入加样孔，避免有气泡产生。 ③电泳：浓缩胶：电压100V 、电流400mA ，电泳20min ；分离胶：120V ，400mA ，电泳50min ，待溴酚蓝到达凝胶底部，关闭电源。

④蛋白质转膜：恒压转移，转膜参数：电压100V ，电流350mA ，转移23min 。结束后，将硝酸纤维素膜（nitrocellulose ，NC 膜）于丽春红染液中染色10 min，可

见清晰的红色条带，表明转膜成功。去离子水冲洗，根据蛋白质Marker 的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm ）裁下。

⑤封闭：把NC 膜置于封闭液内室温封闭4h （摇床上进行），TBST 液洗膜2min×3次。

⑥免疫反应：将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜，TBST 溶液洗3min×5次后，NC 膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 溶液中孵4℃育1h ，用TBST 溶液洗膜3min×5次。以上步骤均在摇床上进行。

⑦曝光：将ECL 超敏发光液中的A 液和B 液按1：1比例混合后滴于NC 膜上，暗室内曝光30s ，X-光片在显影液中显影2min ，定影液中定影5min 。

⑧分析结果：将NC 膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑，IPP5.0图像分析系统分析结果。

（二）免疫组化（荧光）染色实验

1. 免疫组化（荧光）染色主要实验试剂

防脱片剂

一抗抗体

免疫组化试剂盒（SP 或SABC ）

DAB 试剂盒

罗丹明标记的羊抗兔IgG 组织自身荧光淬灭剂 其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯

2. 常用试剂的配制

（1）0.01MPBS 溶液：中衫公司的PBS 粉末一包，加蒸馏水2000mL ，混匀，室温保存。

（2）4%多聚甲醛溶液：500ml 0.01MPBS液加40g 多聚甲醛在2000 ml的烧杯内加热至60℃，边搅拌边加热，至溶液呈澄清，另加500 ml 0.01MPBS液至1000 ml。冷却后过滤， 4℃冰箱保存备用。

（3）苏木素：

（4）伊红：

3. HE染色方法

（1）二甲苯I 脱蜡10min

（2）二甲苯II 、III 脱蜡各5min

（3）无水乙醇洗1min ×2次

（4）95％酒精1min

（5）90％酒精1min

（6）85％酒精1min

（7）自来水洗2min

（8）苏木素染色1～5min

（9）自来水洗1min

（10）1％盐酸酒精分化20s

（11）自来水洗1min

（12）稀氨水（1％）反蓝30s

（13）自来水洗或蒸馏水洗1min

（14）伊红染色20s ～5min

（15）自来水洗30s

（16）85％酒精脱水20s

（17）90％酒精30s

（18）95％酒精1min

（19）95％酒精1min

（20）无水乙醇2min

（21）无水乙醇2min

（22）二甲苯I 、II 、III 透明各5min

（23）中性树胶封片

4. 免疫组化染色

(1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE 染色步骤进行；

(2)抗原修复：0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min ，冷却至室温后，PBS 溶液洗3min×3次；

(3)封闭：封闭液室温封闭30min ，弃去封闭液，不洗；

(4)免疫反应：滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内进行），PBS 溶液洗切片

3min×5次后，滴加二抗，室温4℃孵育30min ，PBS 溶液洗切片3min×5次；滴加DAB 试剂、显色。显微镜观察切片，蒸馏水终止显色反应。脱水、透明、封片。

(5)观察：每张切片随机选5个视野，扫描记录，并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。

5. 免疫荧光染色

(1)制作切片：组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE 染色步骤进行；

(2)抗原修复：0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min ，冷却至室温后，PBS 溶液洗3min×3次；

(3)封闭：封闭液室温封闭30min ，弃去封闭液，不洗；

(4)免疫反应：滴加一抗抗体，4℃孵育过夜（保湿盒内进行），PBS 溶液洗切片3min×5次后，滴加罗丹明标记IgG ，室温避光4℃孵育30min ，PBS 溶液洗切片3min×5次；滴加组织自发荧光淬灭剂，室温孵育30min ，PBS 溶液洗3min×3次；滴加抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存。

(5)观察：荧光显微镜观察切片，每张切片随机选5个视野，扫描记录，并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。

（三）RT-PCR 实验

1. RT-PCR主要实验试剂

TRIzol Reagent

DEPC

One Step RNA PCR Kit (AMV)

DNA Marker

琼脂糖

Tris

MOPS

MGP 试剂

去离子甲酞胺

去离子甲醛

其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）均为国产分析纯

2. 常用试剂的配制

（1）DEPC 水(v/v)：在1000 ml去离子水中加入DEPC 1ml，37℃充分振荡过夜，高压灭菌。浸泡实验器具的DEPC 水：在1000 m 去离子水中加入DEPC 1ml ，充分振荡后即可使用。

（2）75%乙醇(DEPC水配制):无水乙醉375ml ，加入DEPC 水定容至500ml 。

（3）0.5M EDAT (pH8.0): EDAT-2Na 186.1g，加DEPC 水至800ml ，充分搅拌。用NaOH 约20g 调pH 至8.0，用DEPC 水定容至1000ml 。高温高压灭菌后分装, 室温保存。

（4）1×Tri-HCl(pH8.0):Tris 121.1g ，加DEPC 水800ml 搅拌溶解后，用浓HCl 约42ml 调pH 至8.0，用DEPC 水定容至1000ml 。高温高压灭菌后分装，室温保存"

（5）10×TE(pH8.0): 100mM Tris-HCI(pH8.0), 1mM EDAT(pH8.0), 加800mlDEPC 水混合均匀后定容至IL 。高温高压灭菌后分装, 室温保存。

（6）EB 染液(200μg/μl)I:澳化乙锭2.0mg ，, 加DEPC 水至10ml, 充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。

（7）1MM 乙酸钠: 68g乙酸钠, 加DEPC 水400ml ，搅拌, 用DEPC 水定容至500ml 。

（8）10×MOPS 电泳缓冲液:41.8gMOPS溶解于700ml 灭菌的DEPC 水中, 用2M 的NaOH 调整到pH7.0, 加20ml 乙酸钠和20 ml MEDAT(pH8.0), 用DEPC 水调整到1L, 避光保存。

（9）10×甲醛变性琼脂糖凝胶：加1.5g 琼脂糖到72ml 灭菌去离子水中，煮沸溶解琼脂糖，将溶液冷却到55℃同时加入10ml 10xMOPS电泳缓冲液和18ml 去离子甲醛后灌胶。

（10）10×甲醛凝胶缓冲液：甘油5ml, 25mg固体澳酚蓝, 25mg二甲苯青FF, 10mM EDAT(PH8.0) 5ml定容至10m 。

（11）1.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖1.5g ，加入100ml l×TBE 电泳缓冲液P(H8.3)后在微波炉内加热溶解，冷却至55℃左右加入EB 染液(终浓度0.5μg/μl) 充分混匀后灌胶。

（12）5×TBE 电泳缓冲液(pH8.3): 54gTris碱，27.59硼酸，20ml 0.5M EDAT(pH8.0),定容至1L 。

（13）6×凝胶载样缓冲液：0.25%嗅酚蓝(m/v)、0.25%二甲苯青(m/V), 30%甘油

水溶液，4℃保存。

3. RNA提取方法

（1）组织取出后立刻至于液氮中。

（2）脑组织称取后在液氮存在下研磨3次成粉末状（需要磨成非常细的粉末, 否则抽提效率会降低）。

（3）待液氮挥发干，立即加入TRIzol ，每100mg 组织加1ml TRIzol，用加样枪吹吸，使样品充分裂解，移入1.5 ml EP管中，静止5min ，以使核酸蛋白复合体完全分离。

（4）在EP 管中加200μL 氯仿，剧烈振荡15秒，静置5min 。

（5）将EP 管在4℃ 12000g ，离心15min ，离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相，一个中间相和一个无色的上层的水相。

（6）用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的中间层)300ml ，加入另一EP 管中。

（7）加入500 μL 预冷过的异丙醇，振荡混匀。-20℃沉淀过夜。

（8）4℃ 12000g ，离心15min ，此时在EP 管中常常能看到白色沉淀，小自移出 上清。

（9）沉淀中加入lml 预冷过的75%乙醇，振荡混匀后4℃ 7500g ，离心5min 。

（10）重复用75%乙醇洗涤RNA 沉淀一次。

（11）去上清，RNA 沉淀于空气干燥5-10min ，, 加入DEPC 水充分济解(难溶时可在55-60℃孵育10min 助溶。

4. RNA定量检测

（1）提取适量总RNA 用1×xTE 稀释200倍，以1xTE 作为空白对照。

（2）分别测定在260nm 和280nm 处的吸光值，纯RNA 的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.7-2.0之间) 。

(3)在260nm 处的吸光度，1OD=40μg/ml NRA。浓度计算公式如下：A260光密度值×40×稀释倍数/1000=μg/μl RNA。

5、琼脂糖变性凝胶电泳质检RNA

（1）在EP 管内建立变性反应:

对照组总RNA （约5μg ）2.0 μl

10×MOPS 电泳缓冲液 2.0 μl

去离子甲醛 4.0 μl

去离子甲酰胺 10.0μl

澳化乙锭(200μg/μl) 1.0 μl

（2）将EP 管置于水浴恒温器中65℃ 温育5min ，取出立刻置丁冰上10min ，然后离心5s ，将所有液体沉淀到EP 管内底部。

（3）加2.0 μl 10×甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。

（4）将1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内，加入足量1×MOPS 电泳缓冲液覆盖凝胶约lmm ，加RNA 样品到凝胶加样孔中。

（5）5V/cm电压下电泳，直到溴酚蓝移出约8厘米，由于电泳过程中电泳缓冲液的pH 值会发生变化，需每小时人工转变缓冲液。

（6）紫外线下观察，拍照。提取质量较好RNA 电泳结果为5s 、18s 和28s 三条带清晰，没有明显的降解，28s RNA条带是18s RNA条带亮度的两倍。

6、RT-PCR 反应

（1）按照试剂盒说明书加入试剂。

（2）RT-PCR 反应。

（3）反应结束后，取PCR 反应液各5μl 进行1.5%琼脂糖凝胶（含EB ）电泳。

（4）5V/em电压下电泳40min 。

（5）紫外线下观察，拍照。

（四）ElISA 实验

1. RT-PCR主要实验试剂

2. ElISA 操作步骤

（1）取右心血液, 在4℃下2000r/min离心10min, 取上层血清。

（2）取出ELISA 试剂盒平衡至室温。

（3）取出反应板每孔分别加入20μl 标准品、20μl 血清于反应板孔中。

（4）每孔加入100μl Zero Buffer,轻轻混匀30秒, 室温温育30min 。

（5）洗板:甩尽板内液体, 用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板, 并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干), 这样反复洗涤5次。

（6）每孔加入150ul 酶联物(Reagent),轻轻混匀10秒, 室温温育30min 。

（7）洗板：与步骤5相同。

（8）每孔加入IO0μl TMB显色液，轻轻混匀10秒钟，置暗处室温温育20 min。

（9）每孔加入50μl 终止液(stop solution)，轻轻混匀30s ；确定兰色变为黄色(重要) ，30min 内在45Onm 处读OD 值。

（10）以OD 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据豚鼠血清样品的OD 值可在标准曲线上查出其浓度。

（五）原位杂交实验

1. 原位杂交实验所需试剂

TriS

曲拉通X-100

吐温-20

DEPC

mRNA 原位杂交试剂盒及专用盖玻片

原位杂交寡核昔酸探针

2. 原位杂交所需试剂的配制方法

（1）DEPC 水：在1000ml 去离子水中加入DEPC 1ml，37℃下充分振荡过夜，高温高压灭菌，浸泡实验器具的DEPC 水：在1000ml 去离子水中加入DEPC1ml 而，充分振荡后即可使用。

（2）组织细胞打孔液：DEPC 处理的构椽酸缓冲液(0.01mol)99.5ml,加入曲拉通X-100 0.5ml，混匀即可。

（3）DEPC 处理的PBS 缓冲液：1000 ml PBS缓冲液(0.01mol)中加入DEPC 1ml， 荡过夜，高温高压灭菌。

（4）0.1 mol TBS: 8.5g NaCI、l.2g Tris用DEPC 处理的去离子水定容至I000ml, 混匀, 用乙酸调pH 至7.5。

（5）过氧化氢封闭液: 市售30%的过氧化氢10ml ，加DEPC 处理的PBS 缓冲液定容至100ml, 此液现用现配。

（6）4%多聚甲醛: 4g多聚甲醛溶于DEPC 处理的双蒸水100ml 中, 50℃加热搅拌，滴加IN 氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解，3号定性滤纸过滤备用。

（7）20×SSC 缓冲液的配制：氯化钠 175.3g 、柠檬酸三钠 88.2g 加 DEPC 处

理的去离子水混合均匀后定容至 1L 。2×SSC 、0.2×SSC 依次稀释 10 倍。

3. 原位杂交实验步骤

（1）取组织，于DEPC 处理的4%多聚甲醛中固定2h ，15%蔗糖(4℃) 脱水1天, 冰冻切片12μm 。

（2）原位杂交合成探针（8μg/ml, 地高辛标记)

（3）切片丙酮中浸泡10min ，DEPC 处理的PBS(0.01M, pH7.4)冲洗3min 。

（4）置打孔液中室温10分钟，以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜，0.01 M PBS冲洗3次, 每次3min 。

（5）加过氧化氢封闭液室温20分钟，以封闭内源性过氧化氢酶，0.01 M PBS冲洗3min 。

（6）滴加复合消化工作液覆盖组织表面，4℃ 20min ，0.01M PBS冲洗3次，0.2× SSC 冲洗一次(室温3min) 。

（7）滴加预杂交工作液(25μl/张) 覆盖组织，37℃孵育盒孵育过夜。

（8）预杂交后，揭去盖玻片，以0.2×SSC 37℃洗3次, 每次5min 。以上步骤所 用洗液均经DEPC 处理。

（9）滴加杂交工作液(25μl/张) 覆盖组织，37℃孵育盒孵育6h 。

（10）揭去盖玻片以2×SSC 37℃洗3次, 每次5min ；0.2×SSC 37℃洗3次, 每次5min ；0.l mol TBS 37℃洗4次, 每次5分钟。

（11）滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育30 min，0.0l M PBS

冲洗3次, 每次5min 。

（12）滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液，37℃孵育30 min，0.0l M PBS 冲洗3次, 每次5min 。

（13）DAB 显色，光镜下观察，当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时，蒸馏水洗终止反应。胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。80%酒精-90%酒精-无水乙醇-二甲苯脱水, 每步4分钟, 中性树胶封片，4℃保存。

或（13） 滴加高敏荧光链亲和素复合物（FITC ）工作液，4℃湿盒孵育 2h 。 0.01M PBS 冲洗，5min ×3 次。甘油封片。