利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺陷症方法的建立
HEREDITAS (Beijing)
2007年12月, 29(12): 1471―1474 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn
研究报告
DOI: 10.1360/yc-007-1471
利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺陷症方法的建立
李艳华, 张胜利, 韩广文, 薛建华, 赵鹏
北京奶牛中心，北京100085
摘要: 牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)是由常染色体上CD18基因单碱基突变(A→G)引起的隐性遗传疾病，隐性基因纯合时导致白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病，患病牛的主要特征是机体免疫力降低、易患病从而影响其生产性能的表现，严重影响了奶牛场的经济效益。该工作利用自行设计的特异性PCR引物，通过对PCR、PCR-SSCP条件的筛选和优化，并结合DNA序列测定，建立了PCR-SSCP检测BLAD 有害基因的新方法，该方法简便快捷、准确率高，使用样品宽泛，适合大样本筛选，为奶牛BLAD有害基因的分型和筛选提供了新的方法和思路，为我国奶牛的分子选育提供了可靠的理论依据。 关键词: 奶牛；牛白细胞黏附缺陷症；单链构象多态性
A method for detecting bovine leukocyte adhesion deficiency in Hol-stein calves using polymerase chain reaction-single strand conforma-tion polymorphism analysis
LI Yan-Hua, ZHANG Sheng-Li, HAN Guang-Wen, XUE Jian-Hua, ZHAO Peng
Beijing Dairy Cattle Center, Beijing 100085, China
Abstract: Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) is an autosomal recessive disease caused by A→G mutation in
the CD18 gene. The disease is characterized by greatly reduced expression of the heterodimeric β2 integrin adhesion mole-cules on leukocytes, resulting in multiple defects in leukocyte function and significant deficits on performance traits in Hol-stein cattle. In this study, primers were designed to amplify the CD18 gene fragment and BLAD was detected by PCR-SSCP in a simple, highly accurate and high throughput manner. Results were confirmed by DNA sequencing. This study provides a more reliable and useful method for extensive screening of BLAD and also offers a theoretical basis for molecular diag-nosis in Holstein calves.
Keywords: Holstein cattle; bovine leukocyte adhesion deficiency; SSCP
牛白细胞黏附缺陷症(bovine leukocyte adhesion deficiency, BLAD), 是一种常染色体上单基因控制的隐性遗传缺陷疾病, 是由CD18基因第2外显子
(exon2)的第55位碱基A→G突变引起的[1], 该突变是错义突变, 使128位天门冬氨酸变成甘氨酸, 导致白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而
收稿日期 :2007−04−29; 修回日期: 2007−06−28
基金项目 : 北京市科技计划项目(编号：Y[1**********]21)资助[Supported by program of science and technology of Beijing (No. Y[1**********]21)] 作者简介 : 李艳华(1976−), 女, 黑龙江人, 畜牧师, 硕士, 研究方向：动物分子遗传育种。
Tel: 010-60159771; E-mail: [email protected]
通讯作者 : 张胜利(1962−), 男, 黑龙江人, 研究员, 博士, 研究方向：动物遗传学和奶牛育种。
Tel: 010-62948018; E-mail: [email protected]
1472 HEREDITAS (Beijing) 2007 第29卷
引起临床发病。 临床表现为严重的重复性感染、脓液形成减弱、伤口愈合延迟和白细胞增多为主要特征, 也表现在犊牛初生重低和发育不良等症状
。
BLAD遗传缺陷的发现引起了各国奶牛育种协会和育种工作者的重视, 在美国、日本、丹麦 、荷兰等国家相继报道了在荷斯坦牛群中存在BLAD有害基因, 并都相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种方案, 同时在种公牛系谱上进行明确标注隐性基因的携带情况, 合理地指导种公牛的选种、选配工作, 有效降低了隐性基因的不良影响。 2006年, 马金柱等利用PCR-RFLP技术对黑龙江省的荷斯坦奶牛进行了抽样检测, BLAD的携带率为1.9%。 但在我国种公牛选育中, 尚未开展BLAD隐性有害基因的检测和分子选育技术。
目前, BLAD有害基因的分子检测方法主要是PCR-RFLP (polymerase chain reaction- restriction frag-ment length polymorphism)方法, PCR-RFLP法要求建立阳性对照才能保证准确性, 而且不适合规模化检测, 成本较高。所以, 建立一种准确、快速、经济的检测BLAD有害基因的分子诊断方法是十分必要的, 本文将介绍一种全新的检测BLAD有害基因的快捷、准确的方法—SSCP(Single-Strand Conforma-tion Polymorphism, 单链构象多态性)分析。
1 材料和方法
1.1 材料
选择北京市荷斯坦种公牛为实验材料，从血液中提取基因组DNA，方法见《分子克隆实验指南》(第二版)。
1.2 PCR引物设计及条件优化
依据GenBank上牛CD18基因序列(NO:
Y12672), 用Oligo6.0设计检测BLAD有害基因的特异性PCR引物, 通过对一系列PCR引物的设计、 筛选和优化, 最终确定以下引物序列: BLF/BLR: 52-A CCTTCCGGAGGGCCAAGGG-32/52-AGTAGCTGCCTCACCAATGCG-32, 这对引物在CD18基因中的具体位置如下图所示(图
1)。根据PCR条件优化的结果, 最终确定该引物的复性温度为64℃。
图1 特异性PCR引物在CD18基因中的位置
Fig.1 position of the specific PCR primers in CD18 gene
1.3 PCR扩增
利用上述引物进行PCR扩增, PCR产物长度为162 bp。扩增反应程序为: 94℃预变性5 min: 94℃变性30 s, 64℃复性30 s, 72℃延伸30 s, 进行35个循环; 72℃延伸7 min。扩增反应均在PE GeneAmp 9700热循环仪上进行, 25 μL反应体系中, 引物为25 pmol, 模板DNA 50 ng, Taq酶0.5 U, dNTP浓度为100 mol/L。 1.4 单链构象多态电泳和染色
取扩增产物1.5 μL加入6 μL上样缓冲液于98℃保温10 min, 立即置于冰上直至电泳, 采用12%的acr: bis为29:1的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳, 120 V, 16~18 h, 凝胶电泳结束后, 采用Bassam等(1991)的银染方法染色。
1.5 PCR产物的纯化和序列测定
对SSCP分析后的AA基因型和AB基因型, 分别取2个个体的PCR扩增产物, 以Geneclean试剂盒回收纯化, 然后使用ABI PRISM377 DNA测序仪, 通过Dye primer试剂盒对纯化的PCR扩增产物直接进行正、反方向测序, 进一步验证基因分型的结果。
2 结果与分析
2. 1 PCR-SSCP结果
取3 μL PCR产物用2%琼脂糖电泳检测, PCR扩增结果如图2所示, 得到一条长度为162 bp
的DNA片段, 与实验预期结果相吻合, 可以进行SSCP分析。
图2 奶牛BLAD的PCR扩增结果
1～8：PCR产物; M：100 bp ladder marker。
Fig. 2 PCR result of BLAD
1−8: PCR products of BLAD; M: 100 bp marker.
将扩增的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 结果发现存在2种不同基因型: AA型和AB型, 基因分型结果如图3所示。经后续的测序结果, 野
生型命名为AA基因型, 是正常的牛只, 杂合基因型命名为AB型, 是BLAD的携带者。
第12期
李艳华等: 利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺隐症方法的建立 1473
图3 检测奶牛BLAD的SSCP电泳图
注: AA基因型, 表示正常牛只; AB基因型, 表示BLAD携带者。
Fig. 3 SSCP electrophoresis of BLAD
Notes: AA genotype is normal; AB genotype is carrier.
2.2 测序结果
为了进一步验证基因分型结果, 将具有不同基因型的个体进行测序, 用DNAMAN软件与GenBank上的基因序列进行同源性分析发现, AA型的CD18基因第2外显子(exon2)第55位碱基为A, 与GenBank上的基因序列相同, 该基因型属正常牛只, 在国际上统一采用“TL”标识; 而AB型的CD18基因第2外显子(exon2)第55位碱基为N, 该基因型的牛只是BLAD携带者, 在国际上统一采用“BL”标识。对54头种公牛的DNA样品进行了SSCP分析, 结果表明, AA基因型54头, AB基因型仅有1头, 也就是说, 在所检测的54头种公牛中, 仅有1头是BLAD隐性有害基因携带者, 携带率为1.9%。
测序结果表明, 图3中的基因分型结果是正确的, 而且准确率达99%以上, 说明建立的检测BLAD有害基因的方法是可行的, 不同基因型的测序结果如图4所示。
图4 基因型AA、AB的测序峰图
Fig. 4 Chromatograms of genotypes AA and AB
3 讨论和结论
我国奶牛业与发达国家(如美国、加拿大等)相比,
还存在较大差距, 主要是我国目前奶牛群中良种牛数量较少, 多数奶牛属于杂交改良牛, 生产水平低; 同时缺乏有效的优秀种牛选育和推广体系, 特别优秀种公牛的遗传选择准确性较低, 影响奶牛群改良效果。近几年来, 生物技术的快速发展引发了家畜遗传改良的技术革命, 随着基因检测技术、转基因
技术、体细胞克隆等技术的不断改进和完善, 在分子水平上开展优秀种公牛的选育, 对奶牛的育种和遗传改良都将起到重要作用。
近年来, 国外奶业发达国家在种公牛基因检测和分子选育技术方面都开展了大量的研究工作, 一些隐性缺陷基因的检测技术已经在奶牛育种中广泛应用。例如, BLAD遗传缺陷的发现引起了各国育种者的关注, 在美国、加拿大和欧洲一些国家大量的基因检测和系谱分析发现, 世界非常著名的公牛通常携带该隐性突变基因, 如Hawkeye bull(CANM 369995)是BLAD的携带者。 一头优秀种公牛一生可以生产几十万剂甚至上百万剂冷冻精液, 由于冷冻精液和人工授精技术的普及和广泛应用, 优秀种公牛遗传影响是显而易见的。 可见, 荷斯坦牛群中发现的BLAD遗传缺陷带来的是世界性的问题, 这导致近年来奶牛育种工作者在重视优秀种公牛生产性能表现的同时, 更加重视优秀种公牛是否携带隐性有害基因。
目前, 国外种公牛选育中非常重视BLAD和CVM等隐性遗传缺陷基因的检测, 所有后备种公牛必须经过这些基因的检测, 证明不是隐性有害基因携带者后, 才能进入后裔测定程序做生产性能测定和推广使用。 在许多国家的官方系谱登记中, 要求必须注明隐性有害基因的携带情况。
本实验采用PCR-SSCP和DNA序列测定相结合的方法建立了一种检测BLAD有害基因的新方法—SSCP法[12], 该方法是检测DNA突变最为直观而精确的实验技术手段之一, 对长度在100~300 bp之间的DNA片段突变检测的灵敏度可达100%, 结合序列分析, 可做到对大批量样品的目的DNA片段的“全扫描”分析, 不仅成本低, 而且自动化程度较高, 因此, 在进行BLAD有害基因的诊断分析中,
PCR-SSCP技术是一种准确、快捷、经济的技术手段。
本研究获得了检测BLAD有害基因的特异性PCR引物, 从而建立了检测CD18基因第2外显子A55G突变(引起牛BLAD)的SSCP新方法, 为奶牛BLAD有害基因的检测提供了新的方法和思路。我国现有荷斯坦种公牛及后备公牛1 000余头, 均未进行BLAD隐性有害基因的检测。本研究建立的BLAD基因检测技术可以在全国种公牛站推广应用, 排除隐性有害基因的携带者, 避免和降低优秀种公牛传播扩散隐性有害基因的风险, 为我国奶牛的分子诊断提供了可靠的技术支撑。
1474 HEREDITAS (Beijing) 2007
第29卷
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