氨氧化反应动力学研究_715406348

氨氧化反应动力学研究

1 课题介绍与背景（Introduction） 1.1 氨氧化反应原理及意义

生物脱氮反应是氮的分解还原反应，或称为反硝化作用，它包括把废水中存在的硝酸盐和亚硝酸盐还原成气态氮的反应。但是污水中的氮是以有机氮、氨氮和硝态氮等形式存在的，其中有机氮和氨氮为主要形式。因此在生物处理过程中，有机氮首先被异养型的微生物氧化分解成氨氮，即所谓的氨化作用，然后经硝化作用转变为NO2-和NO3-，最后通过反硝化作用使硝态氮转化成氮气逸入大气。

而硝化反应是由一类自养好氧微生物完成的，它包括两个步骤：第一步称为氨氧化过程，是由氨氧化菌把氨氮转化为亚硝酸盐，氨氧化菌中有亚硝酸单胞菌属、亚硝酸螺杆菌属和亚硝酸球菌属；第二步称为亚硝酸盐氧化过程，由亚硝酸盐氧化菌将亚硝酸盐进一步氧化为硝酸盐，亚硝酸盐氧化菌中有硝酸杆菌属、硝酸螺菌属和硝酸球菌属。氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌统称为硝化菌，它们都利用无机碳化合物如CO3-、HCO3-和CO2作为碳源，从NH3、NH4+或NO2-的氧化反应中获得能量，并在好氧条件下以O2为电子受体。氨氧化、亚硝酸盐氧化及完全消化过程的反应式分别如式（1.1）、（1.2）、（1.3）所示。

氨氮氧化为亚硝酸盐： NH4+1.5O2→NO2+H2O+2H （1.1） 亚硝酸盐氧化为硝酸盐： NO2+0.5O2→NO3 （1.2） 硝化反应总方程式： NH4+2O2→NO3+H2O+2H （1.3） 近年来国内外学者在自然界氮元素循环和废水脱氮领域内的一系列研究表明，在水环境中存在新的氨氮转化途径，即将硝化控制在亚硝化阶段，然后进行反硝化，这一过程即为短程硝化反硝化，与传统的硝化-反硝化工艺相比，短程硝化反硝化可以节省能耗和碳源。

无论传统的硝化-反硝化工艺还是短程硝化反硝化工艺，首先都需要在氨氧化菌的作用下将氨氮氧化为亚硝氮，然后进行后续工艺，因此，对于氨氧化反应动力学的研究，对于实际应用具有一定的指导意义。

1.2 本研究的主要内容

（1）通过参考文献中的氨氧化反应数据，采用生物反应中常用的米-门方程进行拟合； （2）通过查阅相关文献获得常用的底物抑制模型，分别对氨氧化反应数据进行拟合，得到其中拟合最好的底物抑制模型；

（3）尝试对已有的底物抑制模型进行改进，使其拟合结果能更好地符合实测氨氧化反应数据。

2 试验条件（Materials and methods） 2.1 试验装置及运行条件

试验所用反应器为有效容积8.0 L的塑料桶，污泥来源是经过120天富集得到的好氧氨氧化菌混培物。每次接种污泥量1.5 L，淘洗3-4次，沉淀0.5 h，除去上清液，再加入人工配水6.5 L，向反应器中加入叠氮化钠NaN3使其浓度为24 μM，24 μM NaN3可选择性地抑制NO2--N氧化，而不影响NH4+-N氧化，使为NH4+氧化NO2-为唯一的限制步。变化DO而其它影响因素在最佳条件（T=28±2 ℃，pH=8.0±0.2），得到不同DO值下NH4+-N浓度随时间的变化

+

−

+

−

−

+

−

+

情况，试验完毕后再将污泥淘洗2次后倒回富集反应器。每次试验约2-3 h。从反应开始计时起，每隔40 min左右从取样口取样一次，测量溶液中的NH4+-N、NO2--N、NO3--N浓度值。试验装置图如图2.1。

图2.1 试验装置图

人工配水中的主要组分和微量元素组成见表2.1和表2.2。

表2.1 人工配水中主要组分含量

组分 NH4+-N KH2PO4

KCl MgSO4

微量元素

含量 (mg/L) 150 30 110 50 0.4 mL/L废水

表2.2 微量元素的组成

组分 ZnSO4·5H2O FeSO4·7H2O

CuCl2·2H2O

MgCl2·2H2O H3BO3

含量 (mg/L) 80 100 20 50 20

2.2 试验分析项目及测定方法

分析项目和测定方法见表2.3。

表2.3 试验分析项目表

分析项目 pH DO NO2-NO3-NH4+NO2/NO 温度

分析方法

备注

精密pH计法 精密DO计法

N-（1萘基）-乙二胺比色法GB 7493-87

酚二磺酸光度法 GB 7480-87 纳氏试剂分光光度法 GB 7479-87

气体分析仪 温度计

3 试验数据（Results）

本文中所用到的数据仅为参考文献1中研究DO对氨氧化反应速率的影响的结果，不同

DO值下NH4+-N浓度随时间的变化情况如表3.1所示。

表3.1 不同DO值下NH4+-N浓度随时间的变化

t (min)

DO (mg/L)

0.5 1.0 2.0 4.5

0 164.0 164.0 167.5 160.0 40 147.0 139.0 133.5 135.5 80 133.5 114.0 111.5 114.5 120 111.5 90.0 80.0 78.0 160 97.5 61.5 47.0 38.5 200 95.0 29.0 15.0 8.5 240 — 14.5 2.0 1.5 280 — 2.5 0.5 0.2

4 分析与讨论（Discussion）

氨氧化反应速率主要受NH4+-N浓度、DO、氨氧化菌浓度、pH、温度的影响，由于该试验在氨氧化菌的最适pH（7.2~7.8）和温度（28~30 ℃）下进行，因此可不考虑pH和温度对反应的影响；若每次试验开始时所取污泥量相等，考虑到氨氧化菌世代周期长（1~3 d），而每次试验时间控制在4 h之内，故假设在反应周期内，活性污泥中氨氧化菌的性质和数量较

+

稳定；故在每一个固定DO值下，反应速率可认为只与NH4-N浓度有关。

4.1 米-门方程拟合

根据试验得到的不同OD浓度下NH4+-N浓度随时间的变化数据，由NH4+-N浓度对时间作图，所得结果如图4.1所示。在每个周期开始时，NH4+-N浓度与时间的关系与线性关系较为相似，取DO=0.5 mg/L条件下0~120 min的数据、其它DO条件下0~200 min的数据，并进行线性拟合，结果如图4.2所示。DO为1.0 mg/L和2.0 mg/L下线性关系拟合较好，0.5 mg/L和4.5 mg/L条件下拟合结果相对较差，但对于生物反应，这样的结果认为是可以接受的。因此认为在反应前期反应与0级反应接近，图4.2拟合得到的斜率即为不同DO浓度下反应前期0级反应的速率。反应后期，各DO浓度下的曲线逐渐变得平缓，说明随着NH4+-的消耗，反应速率逐渐变慢。

通过以上分析结果，反应特征与米-门方程的反应特征较为相似，因此尝试用米-门方程进行拟合，在每个DO下，对NH4+-N浓度随时间的变化曲线进行多项式拟合，拟合标准为：综合考虑相关系数R>0.999，即R2>0.998和反应末期拟合曲线所得斜率不能为正。拟合结果如图4.3所示。

图4.1 不同DO浓度下的NH4+-N浓度随时间的变化

图4.2 不同DO浓度下反应初期NH4+-N浓度对时间的线性拟合

图4.3不同DO浓度下NH4+-N浓度对时间的多项式拟合

在每一浓度下取拟合结果对该时刻的倒数，得到该浓度下的瞬时反应速率。所得结果如表4.1所示。

表4.1 不同DO浓度下的NH4+-N浓度Snh与反应速率v

DO=0.5 mg/L Snh

—

—

DO=1.0 mg/L 164.0 26.676 139.0 36.180 114.0 41.652 90.0 43.092 61.5 40.500 29.0 33.876 14.5 23.220 2.5 8.532

DO=2.0 mg/L 167.5 29.544 133.5 42.504 111.5 49.704 80.0 51.144 47.0 46.824 15.0 36.744 2.0 20.904 — —

DO=4.5 mg/L

v

160.0 14.598

135.5 36.198 114.5 46.278 78.0 44.838 38.5 31.878 8.5 7.398 — — — —

nhnhnh

147.0 23.448

133.5 32.376 111.5 45.912 97.5 54.840 95.0 49.944 — — — —

注：Snh的单位为mg NOD/L，v的单位为mg NOD/(L·h)。

以氨氮浓度为横坐标、反应速率为纵坐标作图，结果如图4.4所示。可见，DO=1.0、2.0、4.5 mg/L条件下，当NH4+-N浓度小于100 mg/L时，曲线形式与米-门方程形式相似，但当NH4+-N浓度大于100 mg/L之后，随着NH4+-N浓度的增大，反应速率反而减小，这说明当NH4+-N浓度过大时，出现了底物抑制现象，可能是由于NH4+-N浓度过高时，导致水中游离氨的浓度增大，而游离氨对氨氧化菌体内催化氨氧化过程的酶的活性是有抑制作用的。当OD=0.5 mg/L时，也可以看到NH4+-N浓度过高反应速率受到了抑制，由于在试验数据不足，导致在较低浓度曲无法得到较完整的曲线。因此采用米-门方程对反应进行拟合不能很好的符合试验结果，需要使用底物抑制模型。

图4.4 不同DO浓度下氨氧化速率v与NH4+-N浓度Snh

4.2 底物抑制模型拟合

查阅相关文献，在底物抑制方面的模型主要有以下4种： Haldane模型： v=

vmaxSS2

Ks+S+

KIH

（4.1）

Edwards模型： v=vmax(exp(−

SS)−exp(−)) （4.2） KIEKS

Aiba模型： v=

vmaxSSexp(−) （4.3）

KS+SKIAvmaxSS

(1−(n （4.4）

KS+SSm

Luong模型： v=

其中，v为反应速率，vmax为最大反应速率，S为底物浓度，Ks为半速常数，KIH为Haldance

抑制系数，KIE是Edwards抑制系数，KIA是Aiba抑制系数，Sm是反应速率为零时的底物浓度，n为Luong系数。

4.2.1 Haldane模型拟合

尝试用Haldane底物抑制模型对以上数据进行拟合。采取两种拟合方式：excel线性拟合和origin自定义函数拟合。

对式（4.1）进行变形，得到式（4.2）。

SnhSnh2SK

=+nh+S （4.2） vKIH⋅vmaxvmaxvmax

根据表4.1的数据，求得不同DO下各个氨氮浓度Snh所对应的Snh/v值，其中由于OD=0.5mg/L条件下的数据不足，只对OD=1.0、2.0、4.5 mg/L三种条件进行计算，结果如表4.2所示。

表4.2 不同DO浓度下的NH4+-N浓度Snh与Snh/v

DO=1.0 mg/L Snh

164.0 6.15 139.0 3.84 114.0 2.74 90.0 2.09 61.5 1.52 29.0 0.86 14.5 0.62 2.5 0.29

DO=2.0 mg/L 167.5 133.5 111.5 80.0 47.0 15.0 2.0 —

5.67 3.14 2.24 1.56 1.00 0.41 0.10 —

DO=4.5 mg/L

Snh/v 10.96 3.74 2.47 1.74 1.21 1.15 — —

160.0 135.5 114.5 78.0 38.5 8.5 — —

Snhnh

Snhnh

注：Snh单位为mg NOD/L，Snh/v单位为h。

以各DO下的Snh/v对Snh作图，并进行二次多项式拟合，结果如图4.5。可以看到，在各相近Snh值下，不同DO条件下的Snh/v数据点十分相近，只有DO=4.5 mg/L，Snh=160 mg/L时的数据明显偏离，对其进行二次多项式拟合的结果（图中虚线）也并不理想，R2只有0.8742，造成这一现象的原因可能是：1）DO=4.5 mg/L条件下，氨氮浓度过高对氨氧化菌的抑制作用尤为明显，导致反应速率显著降低，即Snh/v值显著升高；2）Haldane模型在DO浓度过高情况下不能很好拟合氨氧化结果；3）试验测定问题。若认为是试验测定过程中的错误，舍去明显偏离点，对修正后DO=4.5 mg/L的情况进行拟合，拟合结果见图4.5。然而，根据式

而此处拟合的一次项系数均为负，与模型不符。 4.2，拟合多项式的一次项系数1/vmax应为正，

图4.5 不同DO下的Snh/v对Snh的Haldane方程拟合结果

采用origin自定义Haldane函数，对Snh和v直接进行拟合，得到各DO下的Haldane反应速率方程为： DO=1.0 mg/L时，v=

138.26Snh

Snh2

70.23+Snh+

56.35

60.11Snh

5.33+Snh+

，R2=0.901

DO=1.0 mg/L时， v=

Snh321.07

2

，R2=0.567

DO=4.5 mg/L时， v=

429936.24Snh

422780.40+Snh+

Snh

0.01787

2

，R2=0.934

可见，用origin拟合出来的方程形式符合Haldane模型，在DO=1.0 mg/L条件下，origin拟合相

，但origin拟合所得结果更符合实际情况；在关系数（R2=0.901）低于excel拟合（R2=0.978）

DO=2.0 mg/L条件下，origin拟合的相关系数的平方R2=0.567，认为结果也不可信；在DO=4.5

，但所得的vmax=429936.24 mg NOD/L，实际情况无mg/L条件下，相关系数较好（R2=0.934）

法达到，因此认为此时的结果不可信。

4.2.2 Edwards、Aiba、Luong模型拟合

尝试用Edwards、Aiba、Luong方程进行拟合，所用工具为origin。得到各DO条件下三种方程的拟合结果如表4.3。

表4.3 不同DO下Edwards、Aiba、Luong方程拟合结果

模型

DO=1.0 mg/L 方程

R20.926

Edwards

v=90.90(exp(−

SnhS

−exp(−nh))151.0636.20

Aiba

v=

150.45SnhS

exp(−nh)

72.47+Snh43.58

0.933

Luong

v=

61.71SnhS

(1−(nh))0.214

21.90+Snh169.96

DO=2.0 mg/L 方程

0.984

模型

R20.432

Edwards

v=60.29(exp(−

SnhS

−exp(−nh335.4911.86

Aiba

v=

63.25SnhSnh

exp(−

6.19+Snh342.09

0.604

Luong

v=

51.74SnhS

(1−(nh0.061

3.65+Snh167.52

DO=4.5 mg/L 方程

0.843

模型

R20.920

Edwards

v=7547.60(exp(−

SnhS

−exp(−nh91.9890.54

Aiba

v=

89512.86SnhS

exp(−nh)

68535.83+Snh91.38

0.920

Luong

v=

161.88SnhS

(1−(nh))0.275

146.58+Snh144.48

0.988

4.2.3 改进的Haldane模型的提出及拟合

分析Haldane模型拟合不准确的原因，主要是由于图4.5中当氨氮浓度较高时，数据点的Snh/v值增大速度过快，即反应速率降低速率过快。因此，此处尝试仿照Haldane模型的形式，适当提高式（4.1）中分母的次数。即模型的形式为：

v=

vmaxSnhSnhn

KS+Snh+

KIH

利用origin对各DO浓度下的数据进行拟合，所得结果如表4.4所示。

表4.4 改进的Haldane模型拟合结果

DO (mg/L)

方程

R2

1.0

v=

51.31Snh

Snh7.07

15.84+Snh+

3.41×1051.01Snh

Snhn

3.58+Snh+

6.33×1014109.63Snh

Snh5.49

99.19+Snh+

3.07×10

0.992

2.0

v=

0.897

4.5

v=

0.969

4.3 模型拟合结果比较

根据实测数据和各底物抑制模型的拟合结果，分别作各DO下的实测数据点和模型预测曲线，如图4.6所示。各DO下拟合相关系数列表如表4.5。

(a)

(b)

(c)

图4.6 不同DO下各方程的拟合曲线

(a) DO=1.0 mg/L; (b) DO=2.0 mg/L; (c) DO=4.5 mg/L

表4.5 各DO下模型拟合的R2值

模型

DO=1.0 mg/L

R2

DO=2.0 mg/L

DO=4.5 mg/L

Haldane 0.901 0.567 0.934 Edwards 0.926 0.432 0.920 Aiba 0.933 0.604 0.920 Luong 0.984 0.843 0.988 改进的Haldane 0.992 0.897 0.969

当DO=1.0 mg/L时，从图4.6 (a)可以直观地看出五种方程的拟合结果均较好，其中Luong和改进的Haldane方程的预测曲线与实测点吻合情况最好，考察五种方程的相关系数的平方R2，R2均达到了0.9以上，其中改进的Haldane模型的R2达到了0.992，而Luong模型的R2也达到了0.984。

当DO=2.0 mg/L时，从图4.6 (b)看到，模型拟合结果与OD=1.0 mg/L时相比较差，尤其在高浓度曲，较难符合试验结果，只有改进的Haldane模型的预测曲线与试验点较为相近，

达到了0.897，其次是Luong从各模型的相关系数的平方看，改进的Haldane模型的R2值最高，

模型，R2值为0.843，其它三种模型的R2值都过低，表明拟合效果不好。

当DO=4.5 mg/L是，从图4.6 (c)看到，五种方程的拟合结果均较好，其中Luong和改进的Haldane方程以及Edwards方程的预测曲线在高浓度曲与实测结果较为吻合，从各模型的相关系数的平方看，其中Luong模型的R2最高，达到了0.988，而改进的Haldane模型的R2也达到了0.969。

综合以上结果，认为用Luong底物抑制模型和改进的Haldane模型对氨氧化速率进行拟合在DO=1.0~4.5范围内最为准确。DO=1.0, 2.0, 4.5 mg/L条件下的Luong模型和改进的Haldane模型拟合结果分别见表4.3、表4.4。由于底物抑制模型主要用来预测和模拟底物高浓度区的反应速率，对比Luong模型和改进的Haldane模型的曲线在三种溶解氧浓度下的曲线，可见在DO=2.0 mg/L时，改进的Haldane模型与实测点更为吻合，Luong模型曲线有所偏离，因此认为改进的Haldane模型在预测高浓度氨氮对氨氧化速率的抑制作用时较Luong模型更好。

4.4 与已有研究对比

Julian C等于2004年对比了Haldane, Edwards, Aiba, Luong四种底物抑制模型对氨抑制氨氧化的拟合情况，得到的各模型拟合情况如表4.6所示。他们认为Aiba底物抑制模型在对氨抑制氨氧化的拟合中效果最好。

表4.6 Julian C的拟合结果

模型

R2

悬浮生物相系统

固定生物相系统

Haldane 0.808 0.937

Edwards 0.777 0.922 Aiba 0.816 0.935 Luong 0.798 0.927

而从本文的拟合结果可以看到，Aiba模型在DO=1.0 mg/L和2.0 mg/L条件下拟合的R2分别为0.933和0.920,，拟合结果较好，与Julian C的结果相当，但当DO=2.0 mg/L时，拟合的R2降至0.604，与实测数据偏离较多。考虑到在Julian C等的研究中并没有对DO进行控制，即在反应过程中DO值可能是变化的，而O2也是氨氧化过程的反应物之一，因此认为在他们的试验中反应速率实际上是同时受到氨氮浓度和溶解氧浓度的影响的，而他们在拟和时并没有考虑溶解氧的影响，因此是不太合理的。在本文中，由于控制了DO等其它可能影响氨氧化速率的条件一定，因此可认为在每一固定DO下，氨氧化速率仅仅受到氨氮浓度的影响，故拟合结果更具说服力。与Julian C的结论不同，在常用的四种（Haldane、Edwards、Aiba、Luong）底物抑制模型中，本文认为Luong底物抑制模型对氨氮抑制氨氧化的拟合结果最接近实测值。

另外，本文还尝试了对Haldane底物抑制模型进行改进，改进后模型的拟合结果与Luong

模型相当，且在氨氮高浓度区与实测点吻合更好。

5 结论与评价（Conclusion） 5.1 结论

（1）用普遍适用于生物反应的米-门方程无法对氨氧化反应进行拟合，因为当氨氮浓度升至一定值后，随着氨氮浓度的继续升高，氨氧化反应速率不是基本稳定，而是逐渐下降； （2）从实测结果可知，当氨氮浓度高于100 mg NOD/L，即NH4+-N浓度高于30 mg/L时，随

氨氧化速率逐渐降低，出现底物抑制现象。与其他研究比较，在Julian 着NH4+-N浓度的升高，

C等的研究中，悬浮生物相系统中NH4+-N浓度大于50 mg/L时出现底物抑制现象，引起两者差别的原因可能是所用的污泥源及接种量不同、试验条件的差异等； （3）由溶解氧浓度为1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.5 mg/L条件下的试验数据，用Haldane、Edwards、Aiba、Luong四种常用的底物抑制模型进行了拟合，结果表明，Luong底物抑制模型的拟合结果最好，三种DO条件下的拟合方程分别为：v=

61.71SnhS

(1−(nh0.214（DO=1.0

21.90+Snh169.96

（

DO2.0 mg/L

=

）

、

mg/L）、v=

51.74SnhS

(1−(nh0.061

3.65+Snh167.52

v=

161.88SnhS

。这一结果与Julian C的结论有所区别，(1−(nh0.275（DO=4.5 mg/L）

146.58+Snh144.48

他认为用Aiba模型模拟氨氮对氨氧化反应的抑制作用最好。造成两者差异的主要原因是：在Julian C的研究中，并没有严格控制溶解氧的浓度，即没有保证反应中另一种反应物的浓度一定，这样操作无法排除氧气浓度变化对反应速率的影响，有可能给试验结果带来一定的误差，另外本文中的数据是在投加叠氮化钠NaN3完全抑制亚硝化作用的条件下得到的，而在Julian C的研究中是假设NH4+-N浓度高于50 mg/L时，由氨氧化作用形成的亚硝酸盐有30%转化为硝酸盐，而当NH4+-N浓度低于50 mg/L时，所有亚硝酸盐转化为硝酸盐，并没有实际测定氨氧化的速率，这也有可能给试验结果带来一定的误差。 （4）本文提出了一种改进的Haldane模型：v=

vmaxSnhSnhn

KS+Snh+

KIH

，模型拟合结果与Luong

模型相当，且在氨氮高浓度区与实测值吻合更好，三种DO条件下的拟合结果分别为：

v=

51.31Snh51.01Snh

v=DO=1.0 mg/L）、DO=2.0 mg/L）、 n

SnhSnh

15.84+Snh+3.58+S+nh

3.41×106.33×10109.63Snh

（DO=4.5 mg/L）。

Snh5.49

99.19+Snh+

3.07×109

v=

5.2 评价

（1）在本文的数据源文献中（参考文献1），作者主要考察了氨氧化作用、亚硝酸盐氧化作

用及完全消化作用的反应动力学，在考察氨氧化作用的反应动力学时，所用的NH4+-N浓度达到了191 mgNOD/L，但作者认为在所取的氨氮浓度范围内还没有出现底物抑制，其在考虑氨氮对反应速率的影响时，仍然采用了米-门方程进行拟合，而通过本文的结论可知，在作者所取的底物范围内，已经开始出现了底物抑制，因此作者的结果应存在一定的误差； （2）对比本文的数据源文献（参考文献1）和参考文献2中考察氨氧化反应动力学所用的试验方法：参考文献１中是采用投加NaN3选择性抑制亚硝化反应来直接测定氨氧化过程中的相关参数，而参考文献2中采用的是根据亚硝酸盐被氧化为硝酸盐的转化率，通过试验数据推测氨氧化过程中的相关参数。第一种方法的优点是反应单一、数据测定较为准确，缺点是可能会与实际情况有所偏差，因为在实际的废水处理过程中不可能只有氨氧化作用而没有亚硝酸盐氧化作用；第二种方法的优点是反应过程更符合实际情况，缺点是氨氧化反应数据无法直接求出，需要通过亚硝酸盐的转化率推导出，因此可能引入一定的误差；

（3）本文拟合过程中所采用的四种常用的底物抑制模型、以及本文提出的改进的Haldane底物抑制模型，由于都是由试验过程中的数据点归纳出的，因此很难明确模型中各参数的实际意义，但在拟合时除了要考虑拟合相关性高之外，还应考虑是否与实际情况相符，如4.1.2节中用excel对Haldane方程拟和时，虽然相关系数达到了0.97以上，但是由于所得系数vmax为负值，拟合结果完全没有实际意义，因此认为是不可取的。

参考文献：

[1] 张萍. O2/NO2条件下的氨氧化动力学[硕士学位论文]. 重庆: 重庆大学, 2006

[2] Julian C, Irene J, Lorena C, Rolando C, Javier L. Kinetic models for nitrification inhibition by ammonium and nitrite in a suspended and an immobilized biomass systems. Process biochemistry 39: 1159~1165. 2004.