沉淀试验--双向免疫扩散
沉淀试验——双向免疫扩散试验
一、目的要求
1.掌握双向免疫扩散试验的原理和用途；
2.熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。
二、实验原理
可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等）与相应的抗体结合后，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀线，称为沉淀试验（precipitation）。在生理条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化膜，成为亲水胶体。当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化膜变薄；而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。在电解质作用下，各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。
如果抗原成分不纯，免疫动物后可以产生针对不同抗原成分的多种抗体，于是就形成多条沉淀线，如图2-1所示。
图2-1双向免疫扩散试验原理示意图
双向免疫扩散试验（double agar immunodiffusion test）：将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔内，由于抗原和抗体各自向四周扩散，故称双向琼脂扩散试验。若抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合形成抗原抗体复合物，由于该复合物的体积大于琼脂的微小孔隙，于是不能扩散，并逐步聚集在一起形成白色沉淀线。每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。由于抗原抗体在琼脂内的扩散受到浓度、分子量大小与表面电荷的影响，所以沉淀线可以出现在抗原孔与抗体孔之间的不同位置。当抗体浓度过高时，沉淀线就靠近抗原孔，为前带；相反，则沉淀线靠近抗体孔，为后带。如果抗原与抗体的比例合适，则沉淀线位于两孔中间，为等价带，如图2-2所示。
图2-2 抗原-抗体结合的沉淀带形成原理示意图
三、实验用途：
沉淀试验广泛应用于病毒抗原、细菌毒素或寄生虫抗原等的诊断（图2-3），以及各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定等。
四、材料：
（1）耗材：小平皿、1.5mL的离心管、吸头；
（2）试剂：琼脂糖、8.5% 高渗盐水、待检血清、鸡卵白素 (ovalbumin, OVA)、兔抗OVA阳性血清；
（3）仪器：高压锅、打孔器、移液器、湿盒、恒温箱。
五、实验方法：
1.琼脂板的制备：1克琼脂粉溶于100mL 8.5% 高渗盐水，电陶炉溶解，待温度降至55℃左右时，倾注于平皿中，制成厚约3mm左右的琼脂板。
2.打孔：在琼脂板上打梅花孔（如下图所示），孔径为5mm,中间空和周围孔间的距离大约为5mm。将孔内琼脂挑出。用酒精灯火焰封底。
3.加样：将待检血清作倍比稀释，即1：2、1：4、1：8、1：16，分别加至周围孔中，中间加OVA。
4.作用：将琼脂板放置湿盒中，在37℃恒温箱中作用24h。
5.结果观察：抗原抗体在凝胶为扩散，在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带，出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。
五、结果观察
若待检血清孔（A～F）与抗原孔（Ag）之间产生沉淀线，并与阳性对照所产生的沉淀线吻合成一线，则表示阳性。如无沉淀线或与阳性血清沉淀线交叉，则表示阴性。
图2-3 双向免疫扩散试验用于传染病诊断
六、注意事项
打孔加样时，不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。孔间距要相等。加样时注意换吸头。
七、思考题
1. 双向琼脂扩散实验中怎样通过沉淀线来判断抗原与抗体是否对应？
2. 双向琼脂扩散实验中怎样判断待检血清标本中的抗原或抗体的含量？
3. 双向扩散试验怎样分析抗原、抗体纯度？
4. 什么是带现象？什么是前带？什么是后带？其临床意义是什么？