医药 培养基有效期的验证方案-2 精品

培养基有效期的确认

本方案已由下列人员审查并批准

1. 目的：确定日常环境监控、微生物限度检测使用培养基的有效期。

2. 接受标准:

2.1试验用菌悬液每1ml 含菌数应小于100cfu 。

2.2 培养基配制后无菌性检查和营养性检查需符合要求。

2.3 培养基的pH 值应符合相应培养基的要求。

3. 操作程序：

3.1实验仪器及器具：

生化培养箱LRH-250A （广东省医疗器械厂， 30-35℃, 23-28℃, 20-25℃）；XG1.DMX-0.36B 型脉动真空灭菌器（山东医疗器械股份有限公司 编号10.0311）；FE20型pH 计（梅特勒）；灭菌生理盐水；移液管；试管；双碟。

3.2验证培养基：硫乙醇酸盐流体培养基TGB(德国merk) ，大豆酪蛋白消化肉汤培养基TSB(德国merk) ，营养琼脂培养基NA(德国merk) ，萨布罗葡萄糖琼脂培养基SDA(德国merk) 、平板计数培养基PCA(德国merk) 、远腾琼脂培养基ENA(德国merk) 、硫酸月桂醇肉汤LST(德国merk) 、亮绿乳糖肉汤培养基BGLBB (德国merk) 、麦康凯琼脂培养基Mac.A (德国merk) 、大豆酪蛋白消化琼脂培养基TSA(德国merk) 、假单胞菌分离琼脂培养基PIA (BD)、绿脓荧光素测定用培养基PAF (德国merk) 、绿脓菌素测定用培养基PAP (德国merk) 、 甘露醇胆盐琼脂培养基 (MSA) (德国merk) 、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET ）(德国merk) 、沙门氏菌增菌培养基(RVSB) (德国merk) 、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XLD(德国merk) 、麦康凯肉汤培养基Mac.B(德国merk) 、曙红亚甲蓝琼脂培养基EMB(德国merk) 、三糖铁琼脂TSI(德国merk) 、萨布罗葡萄糖肉汤培养基SDB(德国merk) 、梭菌增菌培养基RCM(德国merk) 、哥伦比亚琼脂培养基CA(德国merk) 、肠肝菌增菌培养基EEB-M(德国merk) 、紫红胆汁葡萄糖培养基VRBGA(德国merk)

3.3试验菌:

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus [ATCC 6538]

大 肠 埃 希 菌Escherichia coli [ATCC 8739]

沙门氏菌Salmonella typhimurium [ATCC 14028]

铜 绿 假 单 孢 菌Pseudomonas aeruginosa [ATCC 9027]

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis [ATCC6633]

生孢梭菌Clostridium sporogenes [ATCC 19404]

白色念珠菌Candida albicans [ATCC 10231]

黑曲霉Aspergillus niger [ATCC 16404]

3.4菌悬液的制备：

3.4.1各取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB 管中，30-35℃培养24-48小时，其中生孢梭菌需厌氧培养，取出置2－8℃贮存使用7天，每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约为10－100cfu/ml。

3.4.2取白色念珠菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB 管中， 20-25℃培养48-72小时，取出置2－8℃贮存使用7天。取黑曲霉菌SDA 斜面培养物用灭菌生理盐水洗脱孢子，置2－8℃贮存使用7天。每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约10－100cfu/ml。

3.4.3菌悬液计数

3.4.3.1无菌操作吸取菌悬液1ml ，加入含灭菌稀释剂100ml 的三角瓶中，摇匀成10-2稀释液，同样操作制备10-4和10-6稀释液（必要时也可作更大倍数稀释）。

3.4.3.2每种菌悬液备好二只灭菌双碟和融化好并放至50℃的NA 培养基和RNA 培养基TSA 培养基和SDA 培养基。

3.4.3.3向双碟内注入10-6稀释液（必要时可以是其它浓度稀释液）1ml 。

3.4.3.4向含稀释液的双碟内加入备好的培养基约20ml ，迅速振摇混合稀释液和培养基，并放置使凝固成平板，其中生孢梭菌置于厌养袋中。

3.4.3.5翻转双碟置适宜温度培养(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌30-35℃培养24-48小时，白色念珠菌和黑曲霉菌20-25℃分别培养2-3天和3-5天) 。

3.4.3.6计数平板上的菌落数求出平均值，得到稀释液的菌浓度要求应为含菌10-100 cfu/ml，若不在此范围内可以改变稀释倍数，得到含菌符合要求的稀释液。

3.5实验步骤

3.5.1培养基的制备

3.5.1.1硫乙醇酸盐流体培养基（TGB ）

酪胨（胰酶水解） 15.0g

葡萄糖 5.0g

L-胱氨酸 0.5g

硫乙醇酸钠 0.5g

或硫乙醇酸 0.3ml

新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 ml

酵母浸出粉 5.0g

氯化钠 2.5g

琼脂 0.7g

纯化水 1000ml

用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节pH 值，使灭菌后为7.1±0.2，分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121℃高压灭菌15 分钟，备用。使用前，培养基氧化层的颜色（粉红色）不得超过培养基深度的1/5。否则，须经100 C 水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

3.5.1.2大豆酪蛋白消化肉汤培养基(TSB)

胰酪胨 15.0g

大豆胨 5.0g

氯化钠 5.0g

纯化水 1000ml

用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节pH 值，使其灭菌后pH7.3±0.2, 分装成100ml/瓶，按试剂标签说明要求121℃高压灭菌15 分钟，备用。

3.5.1.3营养琼脂培养基 (NA)

胨

肉浸出粉

琼脂

纯化水 5.0g 3.0g 12.0g 1000ml

根据配制总量，称取干粉适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，加热煮沸至完全溶解，用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH 值，使其灭菌后pH 为7.0±0.2，置121 ℃高压灭菌15分钟，备用。

3.5.1.4萨布罗葡萄糖琼脂培养基： (SDA)

葡萄糖 40.0 g

胨（肉和酪蛋白）

琼脂

纯化水 10.0 g 15.0 g 1000 ml

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH ，使灭菌后为5.6±0.2，置121 ℃高压灭菌15分钟。灭菌前加入氯霉素50mg/L。灭菌后于2-25℃贮存。

3.5.1.5平板计数培养基： (PCA)

胰酶消化酪蛋白

酵母膏

葡萄糖

琼 脂

纯化水 5.0g 2.5g 1.0 g 15.0g 1000ml

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH ，使灭菌后为7.0±0.2，置121 ℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。

3.5.1.6远腾琼脂培养基： (ENA)

蛋白胨

磷酸氢二钾

无水亚硫酸钠

乳糖

阿拉伯胶

琼 脂

纯化水 10.0g 2.5g 3.3g 10.0g 0.3g 12.5g 1000ml

根据配制总量，称取干粉培养基适量（按试剂标签说明要求）于纯化水中，冷却至室温用1N 氢氧化钠或1N 盐酸调节培养基pH ，使灭菌后为7.1±0.2，置121 ℃高压灭菌15分钟。灭菌后于2-25℃贮存。

3.5.1.7硫酸月桂醇肉汤（LST ）

胰蛋白 20.0 g