转染的步骤

使用Lipofectamine2000转染Stealth RNA或者siRNA进入哺乳动物

Lipofectamine 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine 2000转染Stealth RNA或者siRNAj进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。

影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素

在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断）

，包括：

转染的一般性指导

使用Lipofectamine 2000转染Stealth RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：

1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth RNA或者siRNA。

2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。

3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。

4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine 2000和Stealth RNA或者siRNA寡聚物。

5 可以使用invitrogen BLOCK-iT荧光寡聚物(BLOCK-iT Fluorescent Oligo)(目录号 2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT荧光寡聚物说明书，

说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。

需要材料

开始实验前准备下列试剂：

·目的哺乳动物细胞系（使用传代数低的细胞；转染前确信细胞健康和超过90％的存活率） ·目的Stealth RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火缓冲液中）

·Lipofectamine 2000试剂（使用前贮存在+4℃）

·Opti-MEM I 低血清培养基（使用前37℃预热）

·合适的组织培养板及其它

转染步骤

使用Lipofectamine 2000转染Stealth RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，使用下述步骤。参阅下列表格《推荐试剂的量和体积》以确定加入不同组织培养方式的试剂量以及体积。使用推荐Lipofectamine 2000的量作为起始点，针对您的细胞系和Stealth RNA或者siRNA进行条件优化。

1 转染前一天，在不包含抗生素的适量的培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到30-50％。 2 每一个转染样品都要按照如下的方法准备寡聚物- Lipofectamine 2000复合物：

a.在适量的不包含血清的Opti-MEM I 低血清培养基稀释Stealth RNA或者siRNA寡聚物，轻轻混匀。

b.使用前轻轻混合Lipofectamine 2000，然后稀释适量的试剂到Opti-MEM I 低血清培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。

注：在30分钟内混合稀释的Lipofectamine 2000和稀释的寡聚物。更长的孵育时间可能会降低活性。

c.孵育5分钟后，混合稀释的寡聚物和稀释的Lipofectamine 2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染。

3 将寡聚物- LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。

4 37℃，CO2培养箱孵育24-96小时，直到适合进行基因阻断分析。不需要去除复合物或者改换培

养基；然而，在转染后4-6小时改换培养基也不会损失转染的活性。

推荐试剂量和体积

下表列出了通过各种组织培养方式转染细胞时推荐使用试剂的量和体积。使用推荐量的Stealth RNA或者siRNA（参看第4列）和Lipofectamine 2000（参看第6列）作为实验的起始

点，针对您的细胞系和目的基因优化条件。注：20μM Stealth RNA或者siRNA＝20pmol/μl。

参考文献：

1. Gitilin, L.,Karelsky,s.,and Andino,R.(2000) Nature 418,430-434.

2. Yu,J.L.,DeRuiter,S.L.,and Turner,D.L.(2002) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99,6047-6052

先按说明书提供的比例计算要用的lipofectamine 2000和DNA的量，

分别用无血清培养液稀释lipofectamine 2000和要转染的DNA，

按说明书要求的时间混合两种稀释液，

在等待的时间里用无血清培养液洗2两遍细胞，加入适量的无血清培养液，

再将lipofectamine 2000和DNA的混合液加入培养板或培养瓶，放细胞培养箱就行了，过4～6小时换含血清的培养液。洗细胞和加液的时候动作要轻。

想做瞬转，然后24，48，72小时后检测转染的载体对细胞增殖的影响.我所转染的是连有目的片段的PCDNA3.1载体，这种载体是不带荧光的.请问各位大侠，我该用什么方法来检测我的转染是否成功呢?

可以先使用有荧光蛋白的空载体验证整个系统的转染效率，用流式检测就可以了，非常方便。确定转染效率没有问题后可以转染带有目的基因的质粒。

对于转染效果的验证主要取决于你的目的蛋白的性质。主要是mRNA和蛋白水平的验证。mRNA水平可以使用普通PCR或者定量PCR，前者是定性， 后者定量。但是最主要的还是蛋白水平的检测，如果是膜蛋白，那么流式检测最方便，如果是胞外分泌型那么可以用上清做ELISA或者Western都可以， 如果是胞浆分泌型的那么就用Western或者流式都可以。

瞬时转染和稳定转染区别可以理解为：瞬时转染不整合到宿主染色体中，稳定转染一般整合到宿主染色体中

瞬时转染一般在转染后3天以内检测，稳定转染在药物筛选等环境因素作用下可长期稳定表达 瞬时转染目的是瞬时表达，24，48，72，ETC小时后看结果，随着时间再延长，转染质粒会因细胞减数分裂最后慢慢丢失。稳定转染的目的是为了筛 选出长时表达的细胞克隆，外源蛋白的表达量一直持续。