胰岛素放射免疫分析质控血清的研制

第11卷第1期

1998年2月

同　位　素

Jou rnal of Iso topes

. 11　N o . 1

V o l Feb . 1998

沈洪征　黄　颖　彭新杰

(中国药品生物制品检定所, 北京100050)

介绍了亲和层析法制备胰岛素零值血清和胰岛素放射免疫分析质控血清研制的过程。胰岛素为免疫原对豚鼠进行免疫获得抗血清, 将此抗血清直接偶联到溴化氰活化Sepharo se 4B 凝胶上, 制成亲和层析柱, 使正常人血清通过此柱, 胰岛素被特异地吸附在柱中而从血清中除掉。用放免方法测定过柱处理后的血清, 其中不含胰岛素, 经蛋白测定和醋酸纤维素膜电泳检测证明过柱前、后血清蛋白含量和组成未产生明显变化。向此血清中定量加入胰岛素并经标定确定其靶值和允许范围, 即制成低、中和高值质控血清。

关键词　胰岛素　质控血清　亲和层析柱中图法分类号　TQ 467132

胰岛素放射免疫分析药盒在我国已广泛用于临床, 但不同厂家生产的药盒分析结果差异很大, 给临床诊断带来困难。因此研制胰岛素放射免疫分析用质控血清具有重要的临床意义。

制备质控血清的方法一般有两种[1, 2]。一种是直接收集正常与病理血清, 进行适当调配后获得不同浓度的质控样品, 其优点是方法简便, 质控样品与待测样品组分一致。另一种是用适

当的理化方法去除血清中待测物质, 获得零值血清, 然后再定量加入待测物质, 获得所需浓度的样品, 其优点是可以准确控制待测物质浓度, 适于批量生产。鉴于胰岛素高值病理血清收集困难, 非特异吸附法不能将血清中胰岛素完全去除, 因而本文拟采用特异性亲和层析法制备零值血清, 然后定量加入胰岛素, 以获得不同浓度的质控血清。

1　实验材料

111　主要试剂

标准品:世界卫生组织人胰岛素免疫测定用国际标准品(W HO H um an In su lin I R P 66 304) , 人胰岛素免疫测定用国家标准品(91428602) , 人胰岛素生物测定用国家标准品(50428708) 。佐剂:福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂。溴化氰活化Sep haro se 4B 凝胶购于Pharm acia 公司。正常人血清购于上海生物制品研究所, 经检验乙肝表面抗原阴性。胰岛素放射免疫分析药盒为中国原子能科学研究院及上海生物制品研究所提供。其他试剂为国产分析纯。

沈洪征:男, 57岁, 研究员, 放免药品的分析与检定专业收稿日期:1997202221　　修收稿收到日期:1997206220

　第1期　　　　　　　　　沈洪征等:胰岛素放射免疫分析质控血清的研制25

112　主要仪器

美国A bbo tt 实验室A n sr Χ计数器; 国营261厂FT 1901G 1医用Χ谱仪。

2　实验方法与结果

211　抗体制备

, 完全佐剂, 每隔1015m g 胰岛素的佐剂1mL , , , 。部分抗体的滴度曲线示于图1。#。

图1　胰岛素抗体稀释度曲线

212　亲和层析柱的制备

4mL 2#豚鼠抗胰岛素血清在偶联液(011m o l L N aHCO 3, 015m o l L N aC l ) 中透析过

夜, 5g 经处理的溴化氰活化Sep haro se 4B 凝胶置于磨口瓶中, 加入上述经透析的抗体及10mL 偶联液, 上下颠倒摇2h , 吸去偶联液, 以16mL 1m o l L 乙醇胺(pH =9) 饱和剩余活性位点, 用015m o l 0. 1m o l 0. 1m o l L N aC l 、L 醋酸溶液及015m o l L N aC l 、L T ris (pH =8) 交

表1　偶联操作各残液中蛋白和抗体含量测定结果

序号

123456789

样品原抗血清

偶联液乙醇胺醋酸洗涤液(1) T ris 洗涤液(1) 醋酸洗涤液(2) T ris 洗涤液(2) 醋酸洗涤液(3) T ris 洗涤液(3)

体积 mL

[**************]35

蛋白含量 g ・L -[***********][***********][**************]05

1

总蛋白量 m g

[***********][***********]1437010175

抗体含量1) mL

—

0100192

—

—————

　　　　注:1) 抗体含量已换算成原抗血清的体积数

26同　位　素　　　　　　　　　　　　　　　　　第11卷　

替洗涤三次后, 将此凝胶装入柱中, 其柱径114c m , 柱床高度15c m , 置4℃冰箱中备用。以L ow ry 法对偶联过程各残液分析, 用放射免疫分析法测定各残液中的抗体, 结果列于表1。由表1数据可得, 其蛋白偶联率为85%, 抗体利用率大于99%。213　胰岛素零值血清制备

正常人血清加压过滤后, 用微量电子泵在48-, , , 在, :(B B 0接近或略大于100%) , 即过柱处理后血清的空白管结合率接近或略低于试剂空白管结合率) 。用L ow ry 法对过柱处理前、后血清总蛋白含量测定, 结果列于表2。用醋酸纤维素膜电泳法测定血清过柱前、后其中白蛋白含量并计算各种球蛋白与白蛋白的比例, 结果列于表3。表2、3结果表明过亲和层析柱处理仅除去了血清中胰岛素, 而对血清蛋白组成及其含量未产生明显影响。

表2　过亲和层析柱处理前、后血清中胰岛素活性及蛋白含量比较

序号

123

样品体积 mL

7501100500

免疫活性 mU ・L -过柱前

12165. 356. 28

1

蛋白含量 g ・L -过柱前

61. 266. 463. 7

1

过柱后

---

过柱后

63. 163. 265. 4

表3　过亲和层析柱处理前、后血清中蛋白组分及含量比较

过柱处理过柱前

过柱后

白蛋白

67. 968. 2

蛋白组分及含量Α球蛋白Β球蛋白

8. 78. 3

5. 95. 8

Χ球蛋白

17. 317. 6

R 1)

2. 132. 15

　　　　注:1) R 指血清中白蛋白与球蛋白含量之比

214　胰岛素质控血清制备

将W HO 人胰岛素免疫测定用国际标准品50I U L 浓溶液定量加入上述胰岛素零值血清

中, 得到浓度为20、50和100m I 中和高值血清样品并按每瓶015mL 分装, 经冻干U L 的低、和密封后4℃保存备用。215　胰岛素质控血清的标定

取上述制品按015mL 瓶加入双蒸水或去离子水溶解并混匀, 以人胰岛素免疫测定用国家标准品为对照品, 用放射免疫方法对其免疫活性进行标定, 标定中使用了两种质量较稳定的胰岛素放免药盒, 在数据处理中进行了血样空白和试剂空白校正, 每瓶质控血清皆用同种药盒重复标定两次, 并以两次测定均值进行统计分析, 结果列于表4、表5。根据质控血清的允许范围为均值±2倍标准偏差(x ±2s ) 的惯例, 本质控血清的低、中和高值样品的靶值和允许范围分别定为18114(15110-21118) 、51. 80(44. 93-58. 66) 和95. 28(81. 83-108. 7) m I U L , 具体结果列于表6。

-

　第1期　　　　　　　　　沈洪征等:胰岛素放射免疫分析质控血清的研制

表4　用中国原子能科学研究院放免药盒标定本质控血清的结果

序号

1234567-

27

低值(n =2)

17. 18. 17. 18. 17. 18. 20. [1**********]092中值(n =2)

52. 49. 58. 50. 52. . 6563100477高值(n =2)

102. 590. 03. 1. 9. 2794. 82±6. 86

7. 24

1. 7. 40

51. 47±3. 42

6. 65

表5　用上海生物制品研究所放免药盒标定本质控血清的结果

序号

1234低值(n =2)

15. 4017. 8418. 0317. 5317. 18±1. 06

6. 14

中值(n =2)

47. 6754. 9853. 6954. 1552. 29±2. 99

5. 72

高值(n =2)

89. 5296. 35100. 494. 8796. 02±4. 22

4. 40

-

x ±s

%CV

表6　本质控血清靶值和允许范围

样品低值

中值高值

　　　注:1)

-

x ±s m I U ・L -

1

相对偏差1)

-9. 3+3. 6-4. 7

%CV 8. 376. 637. 02

允许范围 m I U ・L -15. 10-21. 1844. 93-58. 6681. 83-108. 7

1

18. 14±115251. 80±314395. 28±6. 72

×100%

预期值

3　讨　论

(1) 在胰岛素零值血清制备时, 曾对胰岛素含量分别为99、74和3. 84m I U L 的血清用活

性碳非特异吸附法去胰岛素, 经处理后血清胰岛素含量分别为7. 33、6. 26和1116m I U L , 证明其具有降低血清中胰岛素的作用, 但不能彻底去除干净。尽管此法已广泛应用于小分子类型激素(T 3, T 4, 甘胆酸等) , 但同时也将其它类似物质无选择的除掉, 使血清成分和颜色发生明显变化。亲和层析法是利用抗原和抗体特异反应去除胰岛素, 实验结果表明除胰岛素被特异吸附外, 血清的蛋白组分、各蛋白含量及血清色泽都无明显变化, 进一步的研究亦证明此法适用于T SH 、GH 和HCG 等大分子多肽蛋白激素。

(2) 经亲和层析柱处理的血清未检出胰岛素, 在质控血清标定中, 其实测值与预期值相对偏差小且无系统偏低或偏高倾向, 证明所用血清中已无“胰岛素本底”存在, 可作为零值血清使用。

(3) 亲和层析柱制备所用的抗体一般是采用先提取IgG , 然后再进行偶联。但这样易使抗体活性下降, 考虑到胰岛素抗体较难得到, 本工作目的是为去除而非提纯胰岛素, 应尽可能保

28同　位　素　　　　　　　　　　　　　　　　　第11卷　

证抗体具有高活性, 并减少抗原抗体反应的空间位阻效应, 因此直接采用原抗血清偶联, 获得较好的结果。

(4) 亲和层析柱中偶联的抗体量极大, 只要有微量抗体脱落, 就能使放免分析无法进行。曾用自行活化的凝胶未得到满意结果, 主要是活化技术问题, 故采用优质凝胶, 严格控制偶联条件, 保证偶联牢固, 充分洗涤亲和层析柱, 。

(5) , , 还是国家标准品对照品, , PC 公司的胰岛素放免, 本质控血清已在全国, 为国产药盒标准化提供了可靠、准确的参考物质。致谢:对我所血液制品室鲍毓珍等指导进行蛋白组成分析及标准品室协助样品冻干表示感谢。

参　考　文　献

1　John S . T he Ex ternal Q uality A ssess m en t of Ho rmone A ssay . J C lin N u tr , 1987, 2:111.

2　Jeffcoate SL . 放射免疫测定的质量控制. 邴圣民译. 上海:上海科学技术文献出版社, 1983. 98-110. 3　付丽成, 孙有香, 韩秀菊. T 3, T 4放射免疫药盒质量控制血清的建立和应用. 中华核医学杂志, 1982, 2:

184.

4　解书平, 付丽成. 我国可的松质控血清的质量考查. 中华核医学杂志, 1989, 9:187.

PREPARAT I ON OF INSUL IN QUAL IT Y CONTROL SERA

FOR RAD I O I M M UNOASSAY

Shen Hongzheng 　H uang Y ing 　Peng X in jie

(N a tiona l Institu te f or the Con trol of P ha r m aceu tica l and B iolog ica l P rod ucts , B eij ing 100050)

AB STRA CT

A n ti 2in su lin sera are ob tained from m ale gu inea p igs i m m un ized w ith po rcine in su lin and are u sed fo r p rep arati on of affin ity ch rom atograp h ic co lum n . T he co lum n is p acked w ith CNB r 2activated Sep haro se 4B coup ling w ith an ti 2in su lin sera . W hen no rm al hum an sera are p assing th rough the affin ity ch rom atograp h ic co lum n , in su lin is adso rbed on the co lum n . A f 2ter p assed th rough the co lum n , these sera are in su lin free by R I A and p ro tein com po siti on of the sera is si m ilar to that befo re the treatm en t by cellu lo se acetate of m em b rane electrop hare 2

sis . T he in su lin quality con tro l (Q C ) sera is p rep ared u sing in su lin free sera in w h ich hum an in su lin added quan titativelly . T he Q C sera (low , m edium and h igh concen trati on ) are cali 2b rated , and the reference values and their li m its are ob tained from statistical resu lts of cali 2b rati on .

Key words 　in su lin 　quality con tro l sera 　affin ity ch rom atograp h ic co lum n