细胞融合的原理与技术(2)

细胞融合的原理与技术

摘要：细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。

1.细胞融合原理

细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。

细胞融合大体分三个阶段进行。第一阶段是制出细胞融合体。首先要用氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。第二阶段是融合子的鉴定。利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。第三阶段是培养融合细胞阶段。融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上，继续生长形成新植物。

1.1动物细胞融合

一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融

合研究中的又一次突破。他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。

1.2植物细胞融合

植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到1960年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。

1.3微生物细胞融合

1975年原生质体融合技术已扩展运用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先报道PEG促使真菌融合,以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。

2.细胞融合技术

细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物

学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。 细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融合三类。

2.1化学诱导融合

2.1.1盐类融合法

此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

2.1.2高钙和高 pH值融合法

Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

2.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)

1974 年发现的高效融合剂聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。

2.2 物理诱导融合

2.2.1 细胞电融合技术

细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳

和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ； 第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。

与使用PEG的化学法相比，电融合诱导法是一种非常高效的细胞融合方法。电融合技术的优点在于：融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程。故这种方法得以在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。该方法的缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。

2.2.2 激光诱导法

激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。使用此技术时， 使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。

激光微束融合法与病毒法、PEG法、电融合法相比较，可选择任意两个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时、定位性强，

损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰地观察整个融合过程，实验重复性好，无菌，无毒性。但它只能逐一处理细胞，不能像其他方法一样同时处理大量细胞。而且由于其所需设备昂贵复杂，操作技术难度大，很难推广应用。在微生物原生质体融合中应用激光微束技，融合效率较低且丧失了高度选择性的优点有赖后续步骤检出融合子激光诱导融合技术仍处在发展初期，还有待进一步完善。

2.3生物诱导融合(仙台病毒(HvJ)诱导法)

1962年日本的冈田善雄(Okada)偶然发现了由日本血凝性病毒(HVJ)或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重。1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融合。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。

但是，利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。

2.4新细胞融合技术

2.4.1离子束细胞融合技术

雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80 年代中期，中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外，离子种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性高，可以用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。此项研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛

选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。

2.4.2空间细胞融合技术

植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，在地面上由于无法排除地球重力的影响，要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。空间站微重力环境没有重力沉降、热对流和静水压等特点，不仅是研究重力生物学问题的理想场所，而且也为那些在地面因重力限制而难以发展的生物技术提供了新的机遇。20世纪80年代以来，德国细胞电融合技术发明家Zimmermann等人在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明，在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。融合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故，杂种细胞活力增加可能是细胞排列时间缩短引起的。最近的飞行试验结果表明在微重力条件下，哺乳动物细胞融合得率增加10倍，有活力的杂种细胞数比地面对照增加2倍。植物有无液泡原生质体的电融合得率，在微重力条件下比地面增加10-15倍。在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性已经开始。

2.4.3非对称细胞融合技术

即利用某种外界因素(常为γ射线，即γ融合，gamma-fusion) 辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核。并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这两个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。

实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线和X射线等照射，为实现供体亲本少数基因的转移，创造种间、属间杂种提供了可能性。值得注意的是，此方法特别适用于细胞质雄性不育基因的转移，通过辐照胞质不育的原生质体，破坏其染色体，与其具有优良性状品种的原生质体融合，从而获得实用的新的胞质不育系。这些都是常规育种所做不到的。

2.4.4高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内(10～40m)产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向(可以是任何预先设计好的方向)以预定的速度(可以是不同种的细胞以不同的速度定向)移动，从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移．由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压发生装置。

高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率．此外，二价阳离子(例如：钙离子)以及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高。

2.4.5基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统(MEMS)技术和微加工技术的发展。微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现．此外由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

3.细胞融合技术的应用及发展前景

纵观细胞融合技术的发展历史，细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。融合剂走过了从活病毒，灭活病毒生物阶段到PEG化学物质阶段；新方法不断涌现，从生物学，化学方法，物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至应用空间技术。融合对象从动物，植物到微生物，从种内扩展到种间，从近缘扩展到远缘。伴随着

细胞融合技术的每一次革新和改进，都会迅速在各个领域得到充分的应用，然后在实际应用中又不断发现新的问题，在解决实际问题中又促使细胞融合技术跃上一个又一个新的台阶，使其日臻完善。动物细胞融合、植物细胞融合、微生物细胞融合以及三者之间的细胞融合不断应用于基础理论研究和人类生产实际。如创造新物种、培育动物新品种、植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖、获得优良的微生物菌种以及药物单克隆抗体和疫苗等有用物质的生产。并且细胞融合技术和基因工程的汇合，使生物工程进入了崭新的发展阶段。

4.参考文献

[1] 李志勇. 细胞工程[M]. 北京:科学出版社, 2003: 3-21.

[2] 罗立新. 细胞融合技术与应用[M].北京:化学工业出版社,2003:1-12.

[3] 孙剑秋, 周冬坡.微生物原生质体融合[ J ].生物学通报,2002, 37(7):9211.

[4] 王蒂，细胞工程学[M].中国农业出版社,2000.306-307.

[5] 郭晓强，杨彩卿. 精卵细胞融合分子机制.细胞生物学杂志. 2007, 29: 361-364

[6] ALVAREZ D M. Cell fusion :Biological perspectives and potential for regenera2 tive medicine[J ]. Front Biosci ,2007 ,12 :1 - 12.

[7] 李保华.细胞融合技术研究进展.

[8] 孙蒙祥,杨弘远,周嫦.用乙二醇诱导选定成对原生质体的融合[J].植物学报,1994,36:489-493.