细菌分离及鉴定的实验方案

从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案

1实验材料：新鲜土壤。

a) 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基； 高氏一号培养基 ；马铃薯蔗糖培养基；

细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基； LB 培养基

b) 试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c) 仪器：有玻璃珠100ml 三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液

管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等

相关培养基的配方:

1.1实验总流程

1土壤取样：

2制备土壤稀释液：

2.1. 称取土壤1g ，放入99mL 无菌水的三角瓶中，振荡 20min ，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL 无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min ，用无菌吸管吸取1mL 土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养

3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。

3.2吸取稀释液

取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、 10-6,10-7土壤稀释液0.1mL ，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板

用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。

细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得

4分离

4.1配置LB 培养基

4.2划线

4.2.1连续划线法

将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28～300C 温室培养。 4.2.2分区划线法

用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C 角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。

4.4斜面培养

将分离好的菌接种到斜面培养基上培养保存 5鉴定

5.1细菌菌的基本形态及运动性鉴定

a) 简单染色步骤 i. 涂片

取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多） ii. 干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准； iii. 染色

将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min iv. 水洗

倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止； v. 干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥； vi. 镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

b) 革兰氏染色步骤 i. 涂片

先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。 ii. 初染

滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min 后水洗； iii. 媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min 后水洗； iv. 脱色

先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s ，立即用水冲洗； v. 复染

先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min 后水洗； vi. 镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。 c) 半固体穿刺法观察细菌运动性 i. 配制培养基

配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；

ii. 在无菌操作台上右手握接种针, 以针挑取菌苔. 垂直刺入半固体琼脂培养

的中心直至接近(但勿触及) 试管底, 然后循原路退出。如图所示：

接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。

5.2细菌菌的生理生化试验

a) 淀粉水解试验 i. 培养基制备

配制淀粉培养基，灭菌后将冷却至50℃左右，无菌操作制成平板； ii. 接种

用记号笔将平板划成四部分，将所鉴定的菌种在不同位置点种。（注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图）。接种完成后贴好标签； iii. 培养

将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时。 b) 葡萄糖发酵试验 i. 培养基配制

将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。 ii. 接种

用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。 iii. 培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。 c) 乳糖发酵试验 i. 培养基配制

将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。 ii. 接种

用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。取盛有乳糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。 iii. 培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。 d) 甲基红试验

i. 培养基的配制

将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。 ii. 接种

用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。 iii. 培养

将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。