质粒DNA的酶切和连接
华南师范大学实验报告
学生姓名 闫红博 学 号 [1**********]
专 业 生物科学 年级、班级 12级生科三班
课程名称 分子生物学实验
实验项目:质粒DNA 酶切、连接、电泳检测
实验类型 □验证□设计□综合 实验时间 2015年4月21日
实验指导老师 实验评分
一、实验目的
1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立;
2、了解影响酶切的因素;
3、掌握DNA 连接酶的性质以及连接体系的建立;
4、了解影响连接反应的因素。
二、实验原理
1、限制性内切酶(restriction endonuclease ):一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA 的内切酶。 2、限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异性位点上,并切割双链DNA 。生物体内能识别并切割特异的双链DNA 序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA 切断的酶,即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA 却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA 分子内部进行的,故名限制性内切酶。
3、DNA 连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA 链上缺口酶,借助ATP 或NAD 水解提供的能量催化DNA 链的5'-PO4与另一DNA 链的3'-OH 生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外) ,而且必须是两条紧邻DNA 链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。4、 常用的DNA 连接酶有两种:来自大肠杆菌的DNA 连接酶和来自噬菌体的T4DNA 连接酶。二者的作用机理类似。
三、实验试剂和材料
1、材料与试剂
酶切反应:
标准pUC19(2686bp)
EcoR Ⅰ及其配套的酶切缓冲液
检测:
0.5×TBE 电泳缓冲液
6×电泳载样缓冲液 、Goldview 、琼脂糖
四、实验步骤
(一)质粒DNA 酶切
在200μl 的薄壁离心管中,按照下表加入试剂(单位:μl )
↓
混匀;点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪) 保温1-2h 进行酶切反应。 ↓
反应结束后, 75℃,保温10min 使酶失活。
↓
电泳检测
样品
代号
无菌水(μ
l) P
H 质粒(μl) 酶切缓冲
液(μl)
E EcoRI
(μl)
Total(μ 10 酶1.0 6 1 2 成份 反应1(标准pUC19)
(二)质粒DNA 的连接
取200 μl 的离心管按下表加入试剂。
↓
混匀后点动离心,将溶液甩至管底
置于已调好温度为12℃-14℃PCR 仪中
↓
保温1-2h 后取出
↓
电泳检测
样品代
号
I ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 7.0 10.0 成分 用量(μl )
f
T
连接缓冲液 T4DNA 连接酶 总体积 2.0 1.0 20
五、实验结果
质粒DNA 酶切实验结果图
结果分析:从左向右,我的是第六条带,没有出现扩散情况。说明没有蛋白质与DNA 结合,酶切条件也比较合适,没有外切核酸酶污染。
质粒DNA 连接酶实验结果图
分析:从左向右,我的是第10个带。对照连接后的电泳图像,可以发现有连接不完整,还有少部分未能连接。
六、实验结果讨论
1. 限制性核酸内切酶的酶切反应应属于微量操作技术,无论是DNA 样品还是酶的用量都很少,必须严格注意吸样量的准确性并确保样品和酶全部加入反应体系。
2. 注意酶切加样的次序,一般先加重蒸水,其次加缓冲液和DNA ,最后加酶。前几步要把样品加到管底的侧壁上,加完后用力将其甩到管底,而酶液要在加入前从-20℃冰箱取出,酶管放置在冰上,取酶液时洗头应从表面吸取,防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液,取出的酶液应立即加入反应混合也得液面以下,并充分混匀。酶液使用完毕后立即放回冰箱,防止酶的失活。