陆地棉中棉所24胚性愈伤组织的诱导及植株再生(1)
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22622文章编号’+" " "
陆地棉中棉所>胚性愈伤组织的诱导及植株再生?
于
A 李凤莲! 王玉芬! 武芝霞! 张朝军! 刘传亮! 马峙英+李付广! 娅+$$$$$$$
河北保定" 河南安阳#%+河北农业大学农学院$B +" " +C ! 中国农业科学院棉花研究所$==" " " &
摘
要’以陆地棉D 中棉所! 为材料进行了全固体体细胞培养$获得了愈伤组织和再生植株F 愈伤组织诱导阶段采#E
用" 继代时间多为(激素由高到低的继代可明显提高胚2" +2" +2" +!$#
文献标识码’H
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自+S ? (年L l ’s N " q s (首次诱导获得棉花体细胞胚和再生植株以来$棉花组织培养发展迅速$有关+M =B ) $B M +" A
已很多$棉花体细胞胚与植株再生的报道@
2zo P+M+P) $&o " $, " q y &" r y ((y q &o y %" q &y q &" }G H H l q NJ K 1l (r " 1$&o y $l &y " }G H H O J K 1l (+o y
响棉花体细胞胚发生的一些因素进行了研究探讨F
+材料与方法
陆地棉中棉所! 来源于中国农业科学院棉花#$
研究所F 去壳剥出棉仁$棉仁用" 2+Q 升汞灭菌=M 无菌水冲洗(次$播于u -培养基中使其萌? , s $q
发F 以B 日龄无菌苗下胚轴为外植体$切成" 2=M
但这些研究大多集中在模式材料%如珂字棉&上$基因型限制仍是棉花体细胞培养的一个难题$生产上大面积推广的优良主栽品种还很难获得成功F 以优良主栽品种D 中棉所! 下胚轴为外植体#E
诱导愈伤$研究了激素变化B 继代方式B 继代时间等的作用效果$获得了胚性愈伤组织和再生植株$建立了体细胞培养植株再生体系F 在此基础上$我们对影
修改稿收到日期’@收稿日期’! " " (
附加外源激素+2" %$, 的切段F 基本培养基为u -*
葡萄糖(琼脂B ! $#
基金项目’国家D 十五E 科技攻关项目和D 项目%? ) (E ! " " ++! " ? +&H H !
万方数据作者简介于娅%女$汉族$硕士$河北石家庄人$研究方向棉花转基因工程F ’+S B ) E &$
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%期
于
娅) 等d 陆地棉中棉所%" 胚性愈伤组织的诱导及植株再生
5, c
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密. 绿色或白色愈伤) 少部分为疏松黄色) 且这两类愈伤往往镶嵌在一起$产生疏松愈伤的诱导率仅为若培养基中无任何激素) 愈伤组织生长3-456-7
且均为致密干燥. 白色或绿色愈伤组织$这说极慢)
明%它启动细胞分裂) " *+在诱导愈伤中是必需的) 速度快) 诱导产生愈伤组织频率高. 质量好) 在棉花组织培养和遗传转化中被广泛应用$
%结果与分析
&’(愈伤组织的诱导和继代
表! 表明) 不同激素组合诱导棉花出愈率不同) 愈伤组织的形态特征差异也很大$含%) " *+的培养基出愈最好) 出愈率达! 且出愈时间早. 速度, , -) 块$而仅含/所出愈伤大多为质地致00和12时)
表(激素对愈伤组织诱导的影响
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L ! 激素组合H J K M B I
N @B 9E C 8? E @C D @=#@A B @C ; D
愈伤形成速度
O @A B E C ID P ; ; F@=>8::G D ; D
快
O 8D ? 缓慢Q :@T 极慢W ; A SD :@T
愈伤形态特征
Q #8P ; >#8A 8>? ; A @=>8::G D ; D 疏松. 淡黄色. 湿润. 有光泽) :) K @@D ; E I #? S ; ::@T ) T ; ? ? E D #:G D ? ; A 多致密. 白U 绿. 干燥7少疏松) 两者镶嵌
) T #U ) F 7V@D ? ? E I #? E ? ; I A ; ; C A S ) 9:E ? ? :; :@@D ; @? #EC :8E F 致密. 白U 绿. 干燥) T #U ) F 2E I #? E ? ; I A ; ; C A S
疏松愈伤诱导率H -M
/C F G >E C IA 8? ; D @=:@@D ; >8::G D ; D
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棉花在愈伤组织形成过程中有一种X 极性现象Y 即愈伤组织先出现于形态学下端) 再逐渐覆盖) 整个切断) 而且近子叶端的下胚轴切段较近根端出愈速度快$我们认为这种现象与下胚轴幼嫩度有关) 即外植体愈幼嫩) 其细胞和组织分生能力愈强) 脱分化能力强) 老化部位脱分化能力较弱$
愈伤组织的继代时间视愈伤组织生长量而不同) 一般5, 43, F 为宜$原则是愈伤组织生长即将
达到顶峰前适合继代) 此时愈伤组织中细胞处于分继代后很容易生长$关于继代方法) 张寒霜裂状态)
%[等Z 认为为了保持愈伤组织的活力) 可将下胚轴与
若胚性愈伤诱导培&’&’(激素的组成我们发现)
养基中添加%所继代的愈伤组织生长迅速) 无) " *) +限度增殖) 约5周培养基%周左右就可长满培养皿) 将耗尽) 显著抑制了胚性愈伤组织的分化$实验表明H 表%表5愈伤继代%次) 培养基中. M ) 激素浓度由高骤降) 胚性愈伤诱导率极高$]! 培养基可达到3, ’%%-) ’%%-$不同激0%. N ! 最低也为3
素浓度和比例是诱导胚性愈伤组织的关键因子H 表
有利于胚性愈伤组织的分化$5M $/00^12) 0系列培养基12含量偏高) 愈伤组织多呈绿色) 较致密) 不利于胚性愈伤的诱导7/00含量偏低) /00U 12比值为! 其中) 比_!4! _‘利于胚性愈伤的分化) 例! 培养基中_!4! _"为最佳$而同样继代%次) 浓度不变) 则胚性愈伤诱导率极低) 仅激素含量低)
为%’" , -$
继代过程中激素由高到低的变化促进了胚性愈伤的诱导分化) 而激素无变化) 含量偏低则不利于胚性愈伤的诱导成功$
愈伤组织一起转接到继代培养基上$我们认为下胚轴由于脱分化的消耗而干瘪) 勿需转移) 只需将适量愈伤组织H 约, 转接继代$正常情况下) 继代后’%I M
的愈伤组织在54! , F 即可恢复生长$&’&胚性愈伤组织的诱导和增殖
愈伤组织连续培养H 试验结果表明) \, F 左右M 或继代培养H 均可获得胚性愈伤组织) 但前%45次M 者诱导率极低) 后者诱导率显著增高$
表&胚性愈伤组织诱导继代过程中激素的变化处理
289:; %a @A B @C ; >#8C I ; F G A E C I? #; E C F G >? E @C@=A ; >G :? G A 8:; B 9A S @C E >>8::G D ; D
V 处理
2A ; 8? B ; C ? @=V
第! 次继代
*O E A D ? A ; >G :? G A ; 第%次继代万方数据*Q ; >@C FA ; >G :? G A ;
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见表5
D ; ; 289:; 5
b 处理
2A ; 8? B ; C ? @=b , ’, ! /’, ! 1200R, , ’, ! /’, ! 1200R,
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西北植物学报
E F
卷
表! 不同激素浓度和比例对胚性愈伤诱导的影响
" #$%&’() ) &*+, -) . /) ) &0&1+*-1*&1+0#+/-1#1.20-2-0+/-1-) 3-04-1&, -1+3&/1. 5*+/-1-) &4$06-1/**#%%5, &,
培养基编号754$&0, -) 4&. /54,
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注Q Q H (C 胚性愈伤组织R 7-+&(C&4$06-1/**#%%5, &,
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S 3#02等提出关于体胚发生机理的预决定和诱导决定学说R 认为在间接体胚发生中V 外植体已分
择体胚发生能力强的胚性愈伤进行继代V 此类胚性愈伤的特点为新鲜Z 黄绿色Z 颗粒状R 经过E J’次选
择继代后V 就能得到生长旺盛的胚性愈伤V 这时胚性不易丢失R 另外V 继代周期一般为E 若周期I J’I . V 过长:胚性愈伤将褐化Z 白化V 并有F G JI G . 以上@V 部分逆转为非胚性愈伤Y 若周期小于E 不利于胚I . V 性愈伤的恢复生长V 又费工费时V 成本较高R
化的细胞先脱分化V 进而再分化:或再决定@R 愈伤组织增殖而进入胚胎发生阶段R 这类被诱导并重新决定的细胞称为诱导胚胎决定细胞:@R 88(W C (W C 的
形成需要生长素V 此时生长素不仅为细胞分裂所必需V 也为细胞进入胚胎状态所必需R 去掉或仅余少量激素并给以合适的培养条件V 8(W C 就能进行体胚发生的表达R 我们的结果符合这一学说R
X H X H X 愈伤组织的选择继代一般认为愈伤组织分为两类V 胚性愈伤和非胚性愈伤R 非胚性愈伤产生时间较早V 接种I 而胚性愈伤多需JL . 即肉眼可见Y
经连续培养或继代培养从非胚性愈伤组织中诱导分化而成R 因此挑选适宜状态的非胚性愈伤继代与胚性愈伤诱导频率高低密切相关R
我们常借助于非胚性愈伤形态特征加以识别R 从状态上观察V 愈伤组织分为’种Q 第一种愈伤组织质地疏松Z 浅黄Z 湿润V 生长缓慢V 培养基消耗慢V 从这种愈伤中容易诱导出胚性愈伤和胚状体Y 第二种愈伤质地干燥Z 黄白色或浅白色V 表被[白霜\生长V 缓慢Y 第三种愈伤组织质地疏松Z 浅黄色V 但分裂增殖迅速V 呈[疯长\趋势V 培养基消耗快R 后两者一般很难或不能诱导分化出胚性愈伤和胚状体R 经验表明V 愈伤组织疏松Z 有光泽Z 颜色呈灰黄或淡黄色Z 非疯长\型为最佳R [X H X H ! 胚性愈伤组织的增殖增殖R
首先V 为了防止胚性愈伤褐化V 继代培养基中加
万方数据>?
活性炭和少量生长素R 第二V 有目的地选入E ;
初始诱导获得的胚
在培养过程中V 我们发现非胚性愈伤连续培养E
个月以上V 可以得到胚性愈伤:图? 和直接再生胚状@体:图E 得到了L 个直接再生胚状体和@R 本实验中V ? G 块胚性愈伤R 有的胚性愈伤和胚状体共生于同一部位V 有的部位不同R 其发生的共同特征为Q 均生长于白色致密或褐化的非胚性愈伤:一般认为V 此类愈底部和固体培养基表面之间R 此类胚性愈伤应及时转出V 否则易重新逆转为非胚性愈伤Y 而胚状体转出后不易再生为完整植株R 其原因需进一步探索R
伤组织状态极差V 不能分化出胚性愈伤和胚状体R @
性愈伤其胚胎发生能力一般较弱V 因此需进行继代
图? 胚性愈伤组织H ? " ]/; 3&&4$06-1/**#%%5, &,
! 期
于
娅? 等Q 陆地棉中棉所! E 胚性愈伤组织的诱导及植株再生
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:讨
论
在陆地棉组织培养中? 能否成功的诱导出胚性愈伤组织是再生植株的关键? 深入研究影响胚性愈伤产生的因素? 探索提高胚性愈伤组织诱导频率的方法具有重要意义>
试验表明? ! ? E K L 能显著促进愈伤组织的诱导形成? 但抑制了胚性愈伤组织的发育>当生长素含量小于细胞分裂素含量时? 利于胚性愈伤的分化>本试验在诱导胚性愈伤过程中? 激素浓度由高骤低的处
图! 直接再生胚状体
%! &" #$’() #*(+, *($(-(*. , ()/01. , #+(12*30
理显著提高了胚性愈伤组织的诱导率>
棉花组织培养中由于不同分化阶段所需激素种类和数量有差异? 单纯改变某一激素含量可能会导致诱导率提高? 如! ? E K L 的添加可以大大提高愈伤
组织的诱导率>但外源激素在棉花体内有一个累积的过程? 激素偏高6不平衡是畸形苗发生率高的原因之一>作为一个优良的组织培养体系? 应综合考虑全局? 使结果最优化? 不提倡追求某一阶段高的诱导率而加大激素用量>
组织培养过程中? 环节多? 继代次数多>选择性继代对于培养成功起着关键作用>若不加选择盲目或全部继代? 则只会徒增工作量? 不利于分化细胞系的筛选? 因此必须善于观察典型状态? 挑取状态最佳有光泽6颜色呈灰黄或淡黄色为佳M 胚性愈伤组织状态为新鲜6黄绿色6颗粒状>
继代时间的控制也很重要>过早? 移入后组织不易恢复生长? 极易死亡M 过迟? 组织易老化或逆转? 不利于诱导率的提高>一般愈伤组织为E 胚性愈伤N ) ? 为! O P:O ) >
4%5胚状体发育和植株再生
将胚性愈伤转入无激素6=培789:加倍的;在胚性愈伤诱导和继代时? 也有少量胚状体产生>胚性愈伤在培养基上的分布状态? 即聚集堆积或分散平铺? 对胚状体发育有一定影响>我们发现少量胚性愈伤分散平铺时? 胚状体诱导率显著高于聚集状态>在胚状体萌发阶段? 为控制胚状
B C
体褐化不能成苗? 需加入活性炭! $从而降低@A ? 褐化率? 提高成苗率>最终我们得到了D 中棉所! 的E F 再生植株G 图:H >
的组织进入下一轮继代>一般愈伤组织状态为疏松6
图:再生植株
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参考文献Q
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张寒霜H 李俊兰H 高鹏H 王海波H ? A G ? W G ? uT 8W X =G %R ! S t V i A T 9Z v 12*30$(-(/#/. -)I J . -, *($(-(*. , #0-[*01/01. , #+X T 8W X
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张献龙H 孙济中H 刘金兰H R E S t G ?
遗传学报H ? C r r C ? ’(G O H Q E $C BE $) %G ^p m p h c o ln c m c o l
蔡小宁H 吴敬音H 佘建明H ? u &i *G ?
江苏农业学报H G ? C r r ) ? ’5G E H Q ! ! O B! :N %w c l m z ‘dw _d g m l k _xy z g c o d k h d g l k n o c p m o p ‘王$S uT 8W " G R
姚源松H 蔡吉凤H 张佩玲H 芳H 毛鸿才H ? G ? G %? ;T 9X \G ? *T 9*
新疆农业大学学报H R S %? C r r ) ? 4-G (12*30/. -) , ’(*. , (0[*($(-(*. , () I J . -, 0[]I J . -) +0, , 0-i w _d g m l k _x +c m , c l m zy z g c o d k h d g l k {m c |p g ‘c h a 万方数据G E H Q O $BO ) %
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西北植物学报
t f 卷
郭余龙*李名扬*裴! " #$+(+. %&’() ,-’) /,’)
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张宝红*刘! h #i +() j 1k $lj ) , %2
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