白骨壤酸性果胶多糖HAM_3_b_的结构分析

Vo. l 31

2010年3月

高等学校化学学报

CHEM I CAL J OURNAL OF CH I NESE UN I VERSI T I E S

No . 3

492~496

白骨壤酸性果胶多糖HA M-3-Òb -Ò的结构分析

方旭波, 江 波, 陈小娥

1

2

1

(1. 浙江海洋学院食品与药学学院, 舟山316004; 2. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室, 无锡214122) 摘要 以分离纯化得到的白骨壤酸性多糖HAM-3-Òb -Ò为研究对象, 采用高碘酸氧化-S m it h 降解、部分酸水解以及甲基化分析等技术对该多糖的结构进行分析. 结果表明, HAM-3-Òb -Ò为典型的鼠李半乳糖醛酸聚糖I 型酸性果胶类多糖, 主链骨架包括:1, 4-连接的A -D -G alp A 构成的无分支的半乳糖醛酸聚糖(光滑区) 和通过A -D -G a l p A 的O 4位与1, 2-和1, 2, 4-L -Rhap 的O 2交替相连构成的含有较多分支的鼠李半乳糖醛酸聚糖(毛发区). 由T-、1, 6-、1, 3, 6-、1, 4-、1, 4, 6-D G a l p 和T-、1, 2-、1, 3-、1, 5-、1, 2, 5-、1, 3, 5-A araf 聚合成的AG Ñ型阿拉伯半乳聚糖、AG Ò型阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖, 构成了HAM-3-Òb -Ò的侧链部分, 通过R ha 残基的O 4位与主链相连. 关键词 白骨壤; 果胶; 多糖; 结构分析; 甲基化

中图分类号 O 629 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2010) 03-0492-05

白骨壤[Avicennia m arina (Fo rsk .) V ierh . ]又名海榄雌, 为马鞭草科海榄雌属植物, 是世界上分布最广的海洋红树植物之一, 在我国主要分布在广东、广西、福建、海南和台湾等省地. 白骨壤含脂肪酸、

类固醇、类黄酮和三萜等成分, 在民间长期被用于治疗风湿、脓肿、溃疡和皮肤病等疾病, 是一种尚未规模开发利用的天然药物资源. 迄今为止, 对该植物活性多糖的研究国内外鲜有报道. 本文分离纯化得到具有生物活性的酸性果胶类杂多糖HAM-3-Òb -Ò. 补体结合实验表明, 该多糖通过经典途径和替代途径的共同作用, 产生显著的抗补体活性, 并呈一定的剂量效应关系. 更深入的药理实验正在进行中. 就化学组成和结构而言, 果胶多糖是植物细胞壁多糖家族中最为复杂的一员. 虽有长久的研究历史, 但至今其化学成分和分子结构尚未完全弄清. 在我国, 果胶在食品、化妆品及医药等行业己得到广泛应用, 但对于不同来源药用植物中果胶多糖的组成、性质尤其是一级结构及其分析方法的深入研究相对较少. 本实验采用部分酸水解和甲基化实验方法, 结合高碘酸氧化和Sm ith 降解等方法对HAM-3-Òb -Ñ的结构特征进行分析, 为进一步研究其构效关系提供了基础.

[1, 2]

[2~4]

1 实验部分

1. 1 材料、试剂与主要仪器

白骨壤水溶性酸性多糖HAM-3-Òb -Ò, 实验室自制. D extran(葡聚糖) T 系列, Phar m ac ia 公司; 标准单糖、半乳糖醛酸和间羟基联苯, Sig m a 公司; D 2O (9919%), 北京北化开元化学品公司; 无水二甲亚砜, A ldrich 公司; N a BD 4, Acpos 公司; C MC [1-Cyclohexy -l 3-(2-mo r pholinoethy l) carbodii m i d e m etho -p -toluene -sulphonate],F l u ka 公司; 碘甲烷, 浙江海川化学品有限公司; 其它(如甘油和赤藓醇等) 试剂均为分析纯. W aters 600高效凝胶过滤色谱仪(配2410折光检测器和M 32工作站), 美国W aters 公司; 日本岛津GC -14A 气相色谱仪; Finnigan Trace M S GC -M S 分析仪, 美国F i n n i g an 公司. 1. 2 实验部分

1. 2. 1 多糖的相对分子质量测定 采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC) 测定多糖的相对分子质量. 将HAM-3-Òb-Ò溶于011m o l/LNa NO 3溶液中, 配成的质量浓度为10m g /mL, 用微孔滤膜过滤后, 进行凝胶过滤色谱分析, 色谱柱条件:U ltrahydroge l L i n ear 300mm @718mm @2mm, 流动相011m o l/L硝

收稿日期:2009-06-30.

基金项目:浙江省教育厅项目(批准号:20070418) 资助.

联系人简介:方旭波, 男, 博士, 副教授, 主要从事天然产物资源的研究. E-m ai:l f xb70@s ohu. co m

TM

N o . 3

方旭波等:白骨壤酸性果胶多糖HAM-3-Òb -Ò的结构分析

493

酸钠, 流速019m L /mi n , 柱温45e , 进样量20L L. 使用Dex tran T -2000, T -580, T-190, T-70, T -10, T -5和M a ltopentaose 的标准品各20L L 分别进样, 用高效凝胶过滤色谱的M 32工作站以保留时间与相对分子质量的对数作出相对分子质量校正曲线, 对照校正曲线, 根据多糖的保留时间求出相对分子

[5]

质量.

1. 2. 2 高碘酸氧化和Sm ith 降解反应 按文献[6]所述方法进行.

1. 2. 3 部分酸水解及产物的化学组成 参照文献[7]方法, 称取HAM-3-Òb-Ò约20m g , 分别加入4mL 0105, 012和015m ol/LTFA 溶液, 封管, 于105e 条件下水解1h . 水解液减压蒸干除去TFA, 加水复溶, 然后用去离子水透析(透析袋截留分子量3500) 48h , 得到低分子量的透过液(HAM-3-Òb -ÒXL , X 代表0105, 012和015, 分别表示TF A 溶液的浓度) 和高分子量的截留液(HAM-3-Òb -ÒXH ), 冷冻干燥, 得到多糖的部分酸水解产物. 总糖含量采用苯酚-硫酸法测定. 糖醛酸采用间羟基

[6]

联苯显色法测定, 以半乳糖醛酸为标准(中性糖含量的测定公式:中性糖=总糖-糖醛酸).

多糖的单糖组成测定:采用气相色谱法, 参照文献[8]的实验步骤进行, 根据单糖标准品与样品的保留时间, 确定单糖种类, 采用色谱峰面积归一法计算其摩尔比.

1. 2. 4 甲基化分析 羧基还原按文献[9]方法进行; 甲基化反应按文献[10]方法进行; 甲基化反应产物的水解、还原和乙酰化参照文献[7]方法, 制备部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(P MAA ). 然后用二氯甲烷萃取, 过Na 2SO 4柱, 收集滤液进行GC -M S 分析. GC -M S 分析参照文献[7]方法进行.

[7]

2 结果与讨论

2. 1 HA M-3-Òb -Ò的相对分子质量测定

HAM-3-Òb -Ò经H PGFC 凝胶过滤色谱进行分析, 图1结果显示, HAM-3-Òb -Ò为均一对称峰

, 表明HA M -3-Òb -Ò已具有摩尔质量均一性. 经过计

5

算, 其重均分子质量(M w ) 为1105@10. 2. 2 HA M-3-Òb -Ò的单糖组成

HAM-3-Òb -Ò经水解和乙酰化后的气相色谱分析结果表明, 其中性糖组成比较复杂, 主要由阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖组成, 另外还有少量葡萄糖、木糖和甘露糖

[8]

(见表1). 糖醛酸测定结果表明其含有

F ig . 1 M w d istribution of HA M-3-Òb -Ò

deter m i nation by H PGFC

4813%的半乳糖醛酸, 由单糖组成结合红外光谱分析

[8]

可以初步推测它是一种酸性果胶杂多糖.

D egradation product G lyceri n Unknown E ryt hritol Rh a mnose A rab i nose

M ol ar rati o of Sm it h degrad ati on products

[1**********]12

7152116M ol ar rati o of HA M -3-Òb-Ò

T ab le 1 Analysis of Sm ith degradation products of HA M-3-Òb -Ò

t R /mi n 6152371234

[***********]

Degradati on produ ct Xyl ose M annose G l ucose Gal act ose

t R /mi n [***********]181623

M ol ar rati o of Sm it h degradati on produ cts

[1**********]1

M o l ar rati o of HA M-3-Òb -Ò

017013

2121914

2. 3 HA M-3-Òb -Ò的高碘酸氧化-S m it h 降解

高碘酸可以选择性地氧化糖分子的连二羟基或连三羟基, 生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸. 反应可定量进行, 每开裂一个C ) C 键消耗一分子高碘酸, 通过测定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量, 有助于判断糖苷键的位置、连接方式、支链状况和聚合度等结构信息

[6]

.

从HAM-3-Òb -Ò的高碘酸氧化曲线(图2) 可知, 反应7d 后, 吸光值达到平衡, 依照标准曲线(图3) 可以计算出1m o l 己糖残基消耗01912m ol 高碘酸. Na OH 滴定结果表明, 高碘酸氧化产生01164m o l 甲酸. 可以看出, HAM-3-Òb -Ò高碘酸氧化后生成甲酸, 说明可能存在着吡喃己糖1y 4和1y 6糖苷键, 高碘酸含量远远大于甲酸生成量的2倍, 说明存在着大量的只消耗高碘酸而不生成甲酸

494高等学校化学学报 V o. l 31

F i g . 2 O xi dation curve of HA M-3-Òb -Òreacted

i n 01015mo l/LNaI O 4solut i

on

Fig . 3 Ca librat i on cu rve for deter m i nation of

NaI O 4

的类型. 由于该多糖是一种糖缀合物, 其氧化产物不能以一般均聚糖来推算, 但可定性说明HA M -3-Òb -Ò具有较多分支, 存在吡喃己糖的1y 2, 1y 2, 6, 1y 4, 1y 4, 6和戊糖的1y 和1y 5糖苷键.

Sm ith 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解. 由于糖基之间以不同的位置缩合, 用高碘酸氧化后则生成不同的产物. 将氧化产物还原成稳定的多羟基化合物, 经酸水解后用纸层析或气相色谱鉴定水解产物, 由降解的产物可以推断糖苷键的位置

[6]

. 一般以甘油、赤藓醇和其它糖

等作为糖苷键的特征终产物. HAM-3-Òb -Ò的Sm ith 降解产物气相色谱测定结果见表1. 由表1可知,

HAM-3-Òb -Ò的Sm ith 降解产物中检出大量的甘油, 说明存在吡喃己糖1y 、1y 6、1y 2、1y 2, 6糖苷键, 甲酸生成量显示此多糖应为多分支结构或1y 6键较多; 检出少量的赤藓醇, 说明还存在吡喃己糖的1y 4、1y 4, 6糖苷键; 检出鼠李糖、阿拉伯糖及半乳糖, 说明多糖存在部分抗高碘酸氧化的糖链结构

[8]

; 另外还可能存在鼠李吡喃糖、半乳吡喃糖的1y 3、1y 2, 3、1y 2, 4、1y 3, 4、1y 3, 6、1y 2, 3, 4

或阿拉伯呋喃糖的1y 2、1y 3、1y 5、1y 2, 5、1y 3, 5糖苷键. 由于1y 4连接的半乳糖醛酸经高碘酸氧化再经硼氢化钠还原, 还原产物完全酸水解生成乙二醛和乙二醇, 根据HAM-3-Òb -Ò与HAM-3-Òb -Ò-Sm it h 的摩尔比对照, HAM-3-Òb -Ò的鼠李糖极有可能以1y 2, 1y 2, 4连接为主, 阿拉伯呋喃糖极有可能以1y 、1y 2、1y 3、1y 5、1y 2, 5、1y 3, 5形式为主, 半乳糖极可能以1y 、1y 4、1y 6、1y 3, 6、1y 4, 6连接为主, 极少量以1y 3形式存在, 半乳糖醛酸极有可能以1y 4连接为主. 一般来说, 对于结构简单、分支和取代基少的多糖, 由高碘酸氧化和Sm it h 降解能够得到一些确切的结构信息, 但由于HAM-3-Òb -Ò的结构非常复杂, 所以还需要结合更多的分析手段对其结构进行深入研究. 2. 4 HA M-3-Òb -Ò的部分酸水解

多糖中糖苷键的水解难易程度与单糖构型及其取代基、糖苷键的类型与构型及糖环构型等有关. 一般位于支链的糖苷键比主链糖苷键容易水解; 五环糖苷键较六环糖苷键易于水解; A -糖苷键比B -糖苷键易水解; 位于非还原性末端的中性糖, 尤其是呋喃糖, 更易于水解; 而与糖醛酸相连的糖苷键则难以水解等. HAM-3-Òb -Ò中含有戊糖、己糖和糖醛酸, 其水解的难易程度存在差异, 因此, 选择不同程度的部分酸水解条件, 可以初步确定多糖的主链和支链的糖组成.

分别用0105, 012和015mo l/LTFA 溶液对HAM-3-Òb -Ò水解并进行透析, 然后分析不同程度酸水解产物的化学组成和总的单糖组成, 结果见表2和表3. 部分酸水解结果表明, HAM-3-Òb -Ò经0105m o /LTF A 水解后, 大部分的阿拉伯糖被水解, 而半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸只被水解了少部分; 经012m o l/LTF A 水解后, 透过液水解产物主要是阿拉伯糖和半乳糖; 经015m o l/LTF A 水解后, 透过液水解产物半乳糖的含量达到最高点, 而截留液中鼠李糖和半乳糖醛酸的含量最高. 由上述结果可以推测, 阿拉伯糖和半乳糖等位于HAM-3-Òb -Ò多糖的支链上, 半乳糖水解速度较

T ab le 2 Chem ical co m positi ons of HA M-3-Òb -Òby partial ac i d hydro l ysis

Frag m en t

*

Con tent of

G al A /(g #100g )

-1

C on t en t of

n eutral/sugars(g #100g ) [**************]

-1

Tot a l s ugar

con tent/(g #100g ) [**************]

-1

F rag m en t

*

C on t en t of

Gal A /(g #100g -1) [**************]

Conten t of

neu tral/sugars(g #100g -1) [**************]

T otal s ugar

con t en t/(g #100g -1) [**************]

HAM-3-Òb -Ò0105L HAM-3-Òb -Ò012L HAM-3-Òb -Ò015L *

[1**********]85

HAM-3-Òb -Ò0105H HAM-3-Òb -Ò012H HAM-3-Òb -Ò015H

0105, 012and 015expressed as the concen trati on ofTFA(mo l/L); H and L expressed as h i gh and l o w M w p roducts .

N o . 3

方旭波等:白骨壤酸性果胶多糖HAM-3-Òb -Ò的结构分析

Table 3 Sugar co mposition s of HA M-3-Òb -Òby par ti al acid hydrolysis

495

Frag m en *t HAM-3-Òb -Ò0105L

HAM-3-Òb -Ò012L HAM-3-Òb -Ò015L HAM-3-Òb -Ò0105H HAM-3-Òb -Ò012H HAM-3-Òb -Ò015H

*

Con tent of sugar res i due(%, m olar fracti on of the total neu tral sugars )

Rha 116

[***********]

A ra [***********]162818

Xyl 112

[**************]

M an [***********]

G al [***********]154316

G l u [***********]

0105, 012and 015expressed as the concen trati on ofTFA ; H and L expressed as high and l o w M w p roducts .

慢, 说明它以较高聚合度与主链相连. 阿拉伯糖水解速度相对较快, 表明它可能以非还原性末端、低聚寡糖形式与主链相连或与半乳聚糖连接形成阿拉伯半乳聚糖. 经015m o l/LTFA 水解后, 截留液中鼠李糖和半乳糖醛酸的含量最高. 该结果表明, 鼠李糖和半乳糖醛酸位于主链上, 形成果胶类多糖的半乳糖醛酸聚糖(光滑区) 和鼠李半乳糖醛酸聚糖(毛发区)

[11~15]

.

2. 5 HA M-3-Òb -Ò的甲基化分析

对于含有糖醛酸的多糖, 直接甲基化分析难度较大, 原因是糖醛酸在酸性条件下不易水解, 因此直接甲基化会使糖醛酸以及与其相连的中性糖信息丢失, 影响甲基化分析结果的准确性. 因此实验采用氘代试剂N a BD 4将多糖样品中的Gal A 还原为中性糖, 同时用氘进行标记(6, 6c -d 2-Gal) 以区别样品中的中性糖(Ga l), 再进行甲基化分析. HAM-3-Òb -Ò经羧基还原和甲基化反应后进行GC /MS 分析, 根据其单糖组成, 结合标准图谱对多糖甲基化碎片中含量较高的峰进行归属, 结果见表4.

T ab le 4 M e thyl a ti on analysis of HA M-3-Òb -Ò

G l ycosyl

resi du e D -GalpA L -Rhap

t R /mi n

P M AA

L i nkage T-1, 4-T-1, 2-1, 2, 4-T-1, 2-1, 3-1, 5-Relati ve

mo l ar rati o

[1**********]

D -G l cp D -Gal p G lycosyl resi due

t R /mi n [***********][***********]1155

P M AA 3-M e -A raf 2-M e -A raf 2, 3, 4, 6-M e 4-G al p 2, 3, 6-M e 3-G al p 2, 3, 4-M e 3-G al p 2, 6-M e 2-Gal p 2, 4-M e 2-Gal p 2, 3, 6-M e 3-G lcp

L i nk age 1, 2, 5-1, 3, 5-T -1, 4-1, 6-1, 4, 6-1, 3, 6-1, 4-Relati ve

m olar ratio

33424192

, 4, 6-M e 4-G al p(6, 6c -d 2) 131952, 3, 6-M e 3-Gal p(6, 6c -d 2) 181702, 3

91202, 3, 4-M e 3-Rh ap 121803, 4-M e 2-Rhap 161933-M e -Rhap

L -Araf

81462, 3, 5-M e 3-A raf 111683, 5-M e 2-Araf -M e 2-Araf 121072, 5

-M e 2-Araf 131312, 3

甲基化分析结果显示, (1) HAM-3-Òb -Ò主要由T -、1, 4-G al p A 、T -、1, 6-、1, 3, 6-、1, 4-、1, 4, 6-Galp 、T -、1, 2-、1, 3-、1, 5-、1, 3, 5-、1, 2, 5-Aara f 以及T -、1, 2-、1, 2, 4-Rhap 组成; (2) Ga l p A 为HAM-3-Òb -Ò的主要糖单元, 绝大部分以1y 4连接, 另有少量的GalpA 残基位于非还原性末端; (3) Rhap 残基主要以1y 2连接, 其中部分Rhap 残基发生O4位取代成为1, 2, 4-Rhap , 还有少量的Rhap 残基位于非还原性末端; (4) T-、1, 2-、1, 3-、1, 5-、1, 2, 5-及1, 3, 5-Aara f 的摩尔比为12B 1B 3B 6B 3B 3, 其中

4218%的A raf 位于非还原性末端, 推断并非所有的T-A araf 残基都连接于阿拉伯聚糖, 也可能位于半乳聚糖侧链或直接与主链的糖残基相连, 从另外一个角度也可说明A raf 的分支度相对较高, 结构比较复杂; (5) T-、1, 4-、1, 6-、1, 4, 6-及1, 3, 6-Galp 的摩尔比为4B 2B 4B 1B 9, 表明Galp 残基主要以1, 6-连接(70%), 其中45%的G alp 残基在O3位有分支, 另外, 还有10%的G alp 残基以1y 4连接, 20%的

[16]

Galp 残基为非还原性末端. 结合阿拉伯半乳聚糖的结构特征, AG Ñ型主链的Galp 残基以1y 4键链接, 而AG Ò型主链的Ga l p 残基则通过1y 3或1y 6键链接, 可以推断位于支链的阿拉伯半乳聚糖以两种形式存在, 即AG Ñ型和AG Ò型, 且以AG Ò型为主

[13~17]

.

根据以上分析结果并结合文献[11~17]报道, 推测HAM-3-Òb -Ò可能具有如下结构特征:(1) HAM-3-Òb-Ò是一种酸性果胶类杂多糖, 属于典型的Ñ型鼠李半乳糖醛酸聚糖, 主链包括1, 4-连接的A -D -GalpA 构成的无分支的半乳糖醛酸聚糖(光滑区) 和通过A -D -Ga l p A 的O4位与1, 2-及1, 2, 4-L -Rhap 的O2交替相连构成的具有高度分支的鼠李半乳糖醛酸聚糖(毛发区); (2) 1, 6-、1, 3, 6-、1, 4-、

496高等学校化学学报 V o. l 31

1, 4, 6-D -Galp 和T-、1, 2-、1, 3-、1, 5-、1, 2, 5-、1, 3, 5-聚合成的AG Ñ型阿拉伯半乳聚糖、AG Ò型阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖, 构成HAM-3-Òb -Ò侧链部分, 通过Rha 残基的O4位与主链相连.

参 考 文 献

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Structure Identification of an A ci dic Pecti n HA M-3-Òb -Ò

fro m A vicennia Mari na (Forsk . ) V ierh .

FANG Xu -Bo

1, 2*

, JI A NG Bo , C H E N X iao -E

21

(1. School of F ood and P har m acy, Zhej i ang O cean Universit y, Zhoushan 316004, China ;

2. S t a teK e y Laboratory of F ood S cience and T echnology, Southern Yang t z e Uni versity, W ux i 214122, China )

Abst ract Avicennia marina (Forsk . ) V ierh . is one of t h e m ostw i d espread m ang r oves species of the wo rl d . The plant is w ide l y used i n t h e treat m ent o f sk i n disease , ail m en ts and w ounds . Researchers have so far focused their attenti o ns on its m ed ici n al f u nctions and che m ical constituents . HAM-3-Òb-Ò, an acidic po l y -sacchar i d es w as obtained fro m Avicennia M arina by a series step of ex traction , iso lation and purification . The

structure w as stud ied by periodate ox i d ation , Sm ith degradation, partia l hydrolysis and m ethylati o n ana l y sis . The resu lts sho w thatHAM-3-Òb -Òis an ac i d ic pecti n -type be long to RG I fa m ily , the backbone of m a i n chain conta i n ed ho m oga lacturonan frag m ents as /s m ooth reg ions 0w ith 1, 4-A -D -G al p A and rha m nogalacturo -nan seg m ents as /hairy reg i o ns 0w ith repeating unit of y 4)-A -D -GalpA-(1y 2)-A -L -Rhap -(1. T-, 1, 6-, 1, 3, 6-, 1, 4-, 1, 4, 6-D Ga l p and T -, 1, 2-, 1, 3-, 1, 5-, 1, 2, 5-, 1, 3, 5-Araf are linked as arab i n ogalactan type Ñ, arabinogalactan type Ò, ga lactan and arabi n an at the c ite ofO4ofRha in the for m o f t h e si d e cha i n . H ence , HAM-3-Òb -Òwas consi d ered a ne w b i o acti v e pecti n fro m Avicennia M ari n a . K eywords Avicenn i a m arina (Fo rsk . ) V ier h. ; Pectin ; Po l y sacchari d e ; Structure i d entificati o n ; M ethy la -ti o n analysi s

(Ed . :H, J , Z)