蛋白质双向电泳
实验报告 蛋白质的双向电泳
罗云云 水产养殖 2010219017
1、第一相等点聚焦电泳的胶条从负极到正极,pH 如何排列,为什么? 答:从负极到正极PH 逐渐减小,也就是PH 值小的的一端位于电泳的正极。
因为蛋白质在大于其等电点的PH 环境中带负电,在小于其等电点的PH 环境中带正点。根据电泳时正电荷向负极移动原理,如果PH 值小的一端位于负极,而此时带正电荷的蛋白质没法再向负极移动,因此只能是PH 值小的一端位于正极。即从负极到正极PH 值逐渐减小。
2、为什么双向电泳(无论是第一相和第二相)过程中,要尽量消除气泡?
答:
第一向:
如果在胶条和含蛋白质的水化液之间存在气泡,则气泡下面的蛋白质不能进入胶条。对结果的影响可分为两种:①如果所有蛋白质在水化液中均匀分布,那么气泡只影响结果的显色程度,即银染后的黑色会减淡。②如果某种蛋白质很少,恰巧只存在于气泡的下面,则气泡对结果的影响是严重的,直接影响电泳结果所能分析出来的样品中所含有的蛋白质的种类。
第二向:
如果放入胶条时在胶条与电泳胶之间产生气泡,气泡会影响其所在通路上的电压分布。其结果有两种:①蛋白质不能通过气泡,该处的蛋白质被遗漏。②蛋白质可绕过气泡,但其所在跑道会发生偏移或改变,且移动距离也会发生改变,直接影响结果分析。
3、平衡液中的DTT 和碘乙酰胺的作用是什么?
答:
①DTT:即二流苏糖醇,它是一种还原剂。可以还原蛋白质中的二硫键为巯基。与巯基乙醇相比效果更好。
②碘乙酰胺:其所用是使蛋白质中由二硫键还原而成的巯基保持还原态。其机制是在DTT 作用的基础上使—SH 与I —CH2—CO —NH2发生反映产生HI 和—S —CH2—CO —NH2。这样使—SH 不能复原。
4、水化液中CHAPS 的作用是什么?它与SDS 有什么区别?
答:CHAPS 是非离子型表面活性剂,有助于不易溶于水的蛋白质溶解。SDS 也是表面活性剂,但它是离子型的,与蛋白质结合后会使蛋白质分子带上大量的负电荷,从而影响蛋白质的等电点。在第一向的等点聚焦时会改变其结果,进而改变最终结果。
5、银染的原理和过程是什么?
答:
原理:通过敏化和漂洗使蛋白质有还原性,而AgNO3中的Ag+可被还原为Ag 而成黑色,从而判断蛋白质的种类和量。