四种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中染色特性的比较分析_张全波
四川解剖学杂志2007年 第15卷 第3期
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论著
四种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中染色特性的比较分析
张全波,冉黎,陆长青,陈红,王凡*
(四川大学华西医学中心基础与法医学院人体解剖学教研室,成都610041)
【摘要】 目的 比较几种核酸染料(Genefinder、Geneview、SYBERgreenI)对于琼脂糖凝胶中DNA/RNA的
染色效果并分析其取代溴化乙锭(EB)用于常规电泳后凝胶中核酸染色的可能性。方法分别使用四种核酸染料对凝胶中的RNA/DNA进行染色并对结果进行比较分析。结果四种染料对RNA/DNA染色结果无明显差异(P>0.05)。结论新型核酸染料Genefinder、Geneview和SYBERgreenI能够代替EB,用于常规凝胶中的DNA/RNA染色。
溴化乙锭;Genefinder;Geneview;SYBERgreenI【关键词】 核酸染色;
【中图分类号】 R737.9 【文献标识码】 A
AComparativeAnalysisonStainingEffIcienciesofFourFluorescent
DyesinPreparativeAgaroseGelElectrophoresis
ZHANGQuan-bo,RANLi,LUChang-qing,CHENHong,WANGFan*
(DepartmentofAnatomy,SichuanUniversity,Chengdu610041)
【Abstract】 Objective ToinvestigatethestainingeffectofGenefinder,GeneviewandSYBERgre-enItotheDNA/RNAsamplesinthegelsandevaluatethepossibleapplicationoftheminroutinenucleicacidstainingasasubstituteforEthidiumBromide(EB).MethodsComparativeanalysiswasperformedontheRNA/DNAstainingefficienciesoffourfluorescentdyesinpreparativeagarosegelelectrophoresis.Results Therewasnoobviousdifferenceamongstainingefficienciesoffourfluo-rescentdyes(P>0.05).Conclusion ThenewnucleicstainsofGenefinder,GeneviewandSYBERgreenImaysubstituteforEBasgeneraldyestufftostainRNA/DNAinthegel.【KeyWords】 Ncleicacidstain;Ethidiumbromide;Genefinder;Geneview;SYBERgreenI 作为生物体内的重要的大分子,核酸是研究生命现象与本质的物质基础,通过对它们的理化性质、复制与转录、表达与调控等的研究,可以了解生命有关的本质规律。因此,对核酸的研究具有及其重要的意义。但核酸肉眼不可见,对其的研究主要是借助一定的仪器来观察它的形态、大小、表达量,其中最常见的也是最简单的是琼脂糖凝胶电泳。EB(EthidiumBromide,溴化乙锭)是实验室最常用的核酸染料,有着简单、快速、灵敏度高的特点,但是由于其有着强烈的致突变能力和中度致癌性,对实验者和周围环境都
[1～3]
有着较大的危害,因此,寻找可靠并更安全的核酸染料成了实验者迫切需要解决的问题。近几年来,新型核酸荧光染料不断推向市场,本文对目前市面上几种常见的核酸荧光染料Genefinder、Geneview、SYBERgreenI和EB对琼脂糖凝胶中RNA/DNA的染色效果、染色特性和可靠性进行分析,对实验者在核酸荧光染料的选择上有着重要的指导意义。
1 材料与方法
1.1 主要试剂核酸染料Genefinder和SYBERgreenI(百维信生物科技有限公司,厦门,中国),Ge-neview(佰路生物科技有限公司,广州,中国),EB(sigma,USA)。载样缓冲液(6×,宝生物,大连,中国)。DNAMaker(Tiangen,北京,中国)。琼脂糖胶Agarosegels(Oxoid,England)。DNA/RNA标准品均由本室提供。其余试剂均为分析纯。
1.2主要设备凝胶电泳系统(北京六一仪器厂,北京,中国),紫外线凝胶成像系统(BIO-RAD,U.S.
A),微量移液器(eppendorf,Germany)。1.3实验方法1.3.1琼脂糖凝胶中RNA电泳染色效果比较分析染色采用前染法,1%的琼脂糖凝胶加热溶解后,加入1μl染料,待其冷却至45℃时倒胶。用TRIZOL提取的总RNA5μl,加入1μl载样缓冲液混匀,进行潜
[作者简介]张全波(1979-),男(汉族),四川省南充市人,四川大学在读硕士,助教。
*E
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SICHUANJOURNALOFANATOMYVOL.15 NO.3 2007
水电泳,电压130V,电流37mA,电泳时间为15分钟。Genefinder做染料时,在电泳之前进行预染,取1ul染料加入5ul载样缓冲液,混匀后,取1μl与5ulRNA样本混匀,室温静置3分钟后进行电泳。电泳结果在凝胶成像系统下拍照并分析。1.3.2琼脂糖凝胶中DNA电泳染色效果比较分析染色方法同RNA。均取片段长度为235bp的β-actin
PCR产物和长度为530bpTGF-β1的PCR产物各3ul
混合后加入四种染料的琼脂糖凝胶中电泳,电压为120V,电流35mA,电泳时间为25分钟。电泳结果在凝胶成像系统下拍照分析,对电泳条带进行密度扫描。用Quantityone-4.4.0(Basic)对图像进行比较
分析(背景本底扣除方法:总体扣除)。得出β-actin和目的片段的灰度值,二者比值用SPSS13.0软件进行方差分析。
缘清晰,maker条带之间分辨清楚,边缘较整齐,对比鲜明,目的条带位置准确。Geneview染色结果背景略偏高。H泳道跑出条带略有扭曲,经检验为加样孔变形所致。2.2.2染色可靠性分析表1 各组核酸荧光染料电泳条带亮度比较(x±s)
组别GenefinderEB
GeneviewSYBERgreenI
电泳条带亮度(INT mm2)
TGF-β1β-actin2726.09±396.962186.37±387.72
2780.72±100.881955.71±198.57
2843.17±425.302514.09±623.78
3050.11±260.701985.26±796.64
四组染料染色结果TGF-β1与β-actin表达量比值无显著差
异(P>0.05)。
3 讨论
EB溴化乙锭是一种常规核酸染料,被广泛用于观察、检测琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶中的DNA/RNA。其含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基,它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并在紫外线激发下呈现红色荧光,其荧光产率比游离染料有所增加[4]。EB作为核酸染料在DNA及RNA电泳中有着条带边缘清晰,背景着色低,灵敏度高的优点,可以检测出1～10ng的样本,RNA及单链DNA因多存在自身配对双链区,故EB掺入量较小,荧光亮度较低,最低检测量为0.1ug[5]。EB可反复使用、重复性高,在平时实验中发现EB胶反复凝融4次染色效果还能得到保证。但其有一个致命的缺点就是可诱发突变,具有潜在致癌性,且具有中等毒性,可能对操作人员造成危害和对环境造成污染.因此实验结束后,应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置,以避免污染环境和危害人体健康。
SYBERgreenI、Genefinder和Geneview是近几年推出的荧光核酸染料,在凝胶核酸染色中的使用方法跟EB相同,但不具有EB的强致突变性和致癌性[6]。SYBERgreenI是一种经济的核酸染料,它与双链DNA(dsDNA)结合后,荧光大大增强,检测灵敏度高于EB。在紫外照射透视下,与双链DNA接合的SYBRGreenI呈现绿色荧光,但稳定性较差(怕光、怕水、怕热),使得染色的重复性较低。它对于
2结果
2.1 RNA染色效果比较如图1
所示
图1 四种染料RNA染色效果
四种染料染出的RNA条带边缘清、锐利,背景清楚,无明显拖尾现象。条带亮度差异符合RNA各条带本身含量差异,条带迁移速率基本一致。EB和SYBERgreenI显示的条带亮度明显高于Geneview和Genefinder。2.2 DNA染色效果比较如图2
所示
图2四种核酸荧光染料PCR产物染色效果比较
A.C.E.G泳道为Maker(2000bpDNAladder),B.D.F.H泳道中,近下端条带为235bp的β-actin,
上端条带为539bp的TGF-β1PCR产物条带。
2.
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有效保护实验操作者和环境,其最大吸收峰为470nm,与该染料结合的核酸在紫外线下呈现绿色荧光,具有安全、灵敏、经济的特点,但是该染料同样能引起有机体突变,在使用时候一样要采取适当的保护措施。Geneview在紫外灯下,使dsDNA呈现绿色荧光,而ssDNA呈红色荧光,因此能较好地区分ds-DNA与ssDNA,将其用于dsDNA/ssDNA的分析,能够取得满意的效果。目前尚未发现Geneview有致癌性,但是在使用中发现它有一定的刺激性,在使用过程中应戴上手套。
通过实验我们发现,虽然显示条带亮度不一致,但四种染料在对RNA染色中均能够起到区分条带、显示浓度差异的和有无降解的鉴定作用。由于RNA易于降解,故实验中未能在样品上进行统一,只是从定性上进行分析。在dsDNA染色中,四种染料染色效果无论是肉眼观察还是统计学分析均无明显差异,显示效果相当。但是本实验中dsDNA片段均较大,且未设浓度梯度,所以无法显示染料之间的灵敏度差异。但是从图上看,显示100～2000bp条带清晰,完全可以满足实验室常用。
在实验室常规核酸染色中,Genefinder、Genev-iew和SYBERgreenI均能满足一般需求,是比EB(上接第8页)数据的准确性。
一般VSD在所测量缺损大小的基础上加2～3mm选择封堵器型号,如缺损右室面有多处破口、膜部瘤瘤体较长等情况可适当增加封堵器型号。本组病例中3例出现多处破口、病变离主动脉瓣较近,常规选用器械封堵有残余分流,增加型号后封堵器影响主动脉瓣的活动因而治疗失败,另1例则因出现Ⅲ°房室传导阻滞而放弃,其余54例在准确测量数据基础上选用合适的封堵器,术中无残余分流,术后随访无溶血、封堵器移位等并发症出现。测量PDA最狭窄处上下径加2～4mm选择标准ADO封堵器型号,部分漏斗型或较小婴儿为避免封堵器造成降主动脉截流可选用成角型或偏心型封堵器。本组54例患儿经介入封堵后,术中均未见残余分流和明显降主动脉截流,术后未出现溶血、封堵器移位等并发症。PS则测量肺动脉瓣环径,以测得数据的1.2～1.4倍数值选择扩张球囊直径。年龄较小患儿因考虑其肺动脉发育的伸展性应选用较小球囊。本组17例病例经球囊扩张后测得右心室和肺动脉压力差均较术前下降30mmHg或50%以上。术中、术后均未出现明显合并症。
如表1所示,DSA测量结果略小于超声,但无统计学意义。因超声检查存在“多普勒溢出”效应,所测数值较实际病变稍大。超声检查能观察病变的部位、,、
更安全、更经济的染料。但是这几种新型染料存在稳
定性差、可重复利用率低和难存放的缺点,且在某些浓度低、片段短的染色中效果不及EB,故目前在某些方面尚不能完全取代EB。
参考文献
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部位、形态显示更明确,测量的数据对封堵器更具参[4]
考性。在实际应用中要将造影与超声结合起来全面考虑。
目前,介入治疗已经成为PDA、单纯型VSD、ASD、PS等先天性心脏病治疗的首选,随着操作方法的不断改进以及技术的熟练,临床工作中失败病例已经大幅降低。而DSA数字测量技术测得的数值直接影响介入器械的选择,测量值过小选择器械过小,可导致封堵器脱落、缺损未完全封闭或狭窄病变未充分扩张;测量值过大选择器械过大则造成术中成形困难、阻挡周围解剖结构等,直接影响手术成败。虽然诸多因素如缺损边缘的软硬度、缺损的大小、有无房室传导阻滞等均可影响介入手术的成功,但在心血管造影过程中应确保操作过程的精确性以及正确的测量方法,以提供准确的测量数据,是先天性心脏病介入治疗获得成功的基本条件之一。
参考文献
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