探究不同浓度南蛇藤素对人肺癌细胞的抑制作用,肿瘤学论文---学术堂

探究不同浓度南蛇藤素对人肺癌细胞的抑制作用

时间：2014-07-03  来源：学术堂

肺癌已成为危害生命健康的主要疾病之一，其发病率与死亡率逐年上升.2012年美国死于肺癌人数约16.0万，新增肺癌患者约22.6万.在我国城市中，肺癌死亡人数由原来的第4位上升为第1位，农村上升最快的死亡人数也是肺癌患者.调查显示在过去30年间，肺癌死亡率在我国上升了46.5%，肺癌已成为我国恶性肿瘤死亡主要原因之一.肺癌发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管肺癌.肺癌一般指的是肺实质部的癌症，非小细胞肺癌则占肺癌总数的80%，其5年生存率仅为15%。

近年来，大量的研究表明:天然植物中存在具有治疗价值的抗癌药物，天然植物药物以其所特有的低毒、有效、无耐药性及整体调节等方面的优势，在肿瘤治疗中起着越来越重要的作用.雷公藤红素(Celastrol)，又名南蛇藤素，是从传统中药卫矛科植物雷公藤属(TripterygiumHook)及南蛇藤属(CelastrusL)，植物中分离出的活性较高的五环三萜类物质，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性，是雷公藤片和雷公藤多甙片中的有效成分，广泛用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、肿瘤等有关疾病的治疗.近来多项研究表明，雷公藤红素可以抑制多种肿瘤细胞株生长，诱导其凋亡，同时，能够通过ＲOS介导的上调CHOP通路，下调促生存蛋白和上调促凋亡蛋白的表达增强TＲAIL诱导的人类乳腺癌细胞凋亡.本研究通过不同浓度的雷公藤红素处理人肺癌细胞，检测药物对这两种细胞生长的抑制作用、细胞凋亡及其形态的影响，为肺癌的临床预防和治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:人肺癌细胞(H727细胞、H1299细胞)购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

1.1.2 试剂:ＲPMI－1640培养基，胎牛血清，双抗，磷酸缓冲生理盐水PBS，胰蛋白酶(均购于Gibco公司)，雷公藤红素(购于上海源叶生物有限公司，纯度≧98%).DMSO(二甲基亚砜，购于上海生工生物工程有限公司)，DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，购于美国Ｒoche公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

H727、H1299细胞细胞株用含有10%的灭活胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、pH7.4的ＲPMI-1640完全培养液于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。

1.2.2 雷公藤红素的配制雷公藤红素用DMSO(二甲基亚砜)配成100mmol/L的母液，－80℃储存.使用前，用含10%胎牛血清的ＲPMI-1640培养液配成不同浓度的工作液，DMSO的终浓度不超过0.1%。

1.2.3 MTT检测细胞活性实验取对数生长期的细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL，按每孔100μL接种于96孔板，放置于37℃、5%的CO2孵箱中过夜培养.待细胞贴壁生长后，加入不同浓度(0，0.25，0.5，1，2μmol/L)的雷公藤红素工作液.同时设置无细胞，只有ＲPMI-1640培养液为对照组，每组设8个平行孔.培养24和48h后，每孔再加MTT(5mg/mL)10μL，放置于37℃、5%的CO2孵箱中培养4h，向每孔加150μL的DMSO，震荡10min，用酶标仪在492nm处测定OD值.按下式计算不同浓度的药品对细胞的生长活性的影响，细胞活性=(给药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.2.4 流式细胞仪测肿瘤细胞凋亡取对数生长期的细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL，接种细胞到6孔板内，放入37℃，5%的CO2培养箱培养过夜，待其长至80%无血清培养18h使细胞同步化.取出6孔板，放在超净工作台上，吸尽培养液，依次加入预先配制好的浓度分别为0、0.5、1μmol/L的雷公藤红素溶液2mL于准备处理的细胞中，培养24h后，收集细胞及其上清液，用凋亡试剂盒进行处理，并进行流式检测。

1.2.5 DAPI染色测肿瘤细胞形态将对数期的H727和H1299细胞接种到6孔板内，细胞数目为1×106/孔，放入37℃，5%的CO2培养箱培养过夜，待其长至80%无血清培养18h使细胞同步化.取出6孔板，分别加入浓度为0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的雷公藤红素，放入37℃，5%的CO2培养箱培养处理24h.PBS清洗2遍，避光加入DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色液0.5ml，室温避光孵育5－10min，PBS清洗4－5遍，用荧光显微镜观察。

2 结果分析

2.1 不同浓度的雷公藤红素对H727细胞、H1299细胞活性的影响

用MTT实验检测雷公藤红素对H727细胞、H1299细胞活性的影响发现，浓度为0、0.25、0.5、1、2、4μmol/L的雷公藤红素处理H727细胞、H1299细胞24h和48h，得出各个浓度细胞的细胞活性见图1和图2.可以看出，不同浓度和时间处理的雷公藤红素对H727细胞、H1299细胞活性的影响不同，它们之间存在着正相关关系，即随着雷公藤红素浓度的增大和处理时间的增长，细胞的活性降低，也就是说，随着雷公藤红素浓度的增大和处理时间的增长，其对H727细胞、H1299细胞活性的抑制作用越大。

2.2 不同浓度的雷公藤红素对H727细胞、H1299细胞凋亡的影响

用细胞凋亡试剂盒检测雷公藤红素对对H727细胞、H1299细胞凋亡的影响发现，浓度为0、0.5、1μmol/L的雷公藤红素处理H727细胞、H1299细胞24h，得出的凋亡率见图3和图4，H727和H1299细胞的晚期凋亡细胞和死亡细胞随浓度的增大而增多。

2.3 不同浓度的雷公藤红素对H727细胞、H1299细胞形态的影响

雷公藤红素处理H727和H1299细胞24h之后，经过DAPI染色处理，可以明显的观察到H727和H1299的细胞核发生变化(如图5、图6)，未经雷公藤红素处理的H727和H1299的细胞核核形完整，染色质均匀，如图中A1和B1.随着雷公藤红素浓度的增大，在浓度为0.5μmol/L时，染色质固缩，向外周聚集，形成周边化，如图中A2和B2、B3，当浓度达到1μmol/L时，染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质，最终细胞核破裂形成碎片，核解体，如图中A3。

3 结果与讨论

中药治病是我国传统的治病方法，所以从中药材中筛选抗肿瘤药材是一个研究的热点.雷公藤红素是从传统中药材中分离出来的一种物质，目前已经用于慢性炎症和自身免疫性疾病的治疗，而最近的研究表明雷公藤红素还具有抗癌活性.本实验研究发现，雷公藤红素能够抑制人肺癌细胞H727和H1299细胞的活性，促进细胞凋亡，并且通过DAPI染色发现，H727和H1299细胞的细胞核发生变化，染色质皱缩，核边缘化，最终形成凋亡小体.从而说明雷公藤红素对肺癌细胞也具有一定的杀伤作用。

本实验选用的雷公藤红素浓度为0，0.25，0.5，1，2μmol/L，作用与肺癌细胞H727和H1299细胞24h后，当浓度达到1μmol/L时，细胞的活性分别只有44.86%和50.98%;处理48h之后，浓度为1μmol/L时，细胞的活性分别只有19.85%和28.17%.有实验研究表明，在雷公藤红素作用滑膜成纤维细胞时，浓度为0.8μmol/L，细胞活性为38%左右［12］;作用于角质细胞时，浓度为1.4μmol/L，细胞的活性为40%左右，由此可知，雷公藤红素对细胞的活性起到一定的抑制作用。

该实验发现:雷公藤红素能够促进细胞凋亡，随着雷公藤红素浓度的增大，晚期凋亡细胞和死亡细胞数量逐渐增大，与之前活性实验结果相一致.通过DAPI染色发现，当雷公藤红素浓度达到0.5μmol/L时，肺癌细胞H727可以明显的看到凋亡小体的出现，H1299则可以看到染色质皱缩、边缘化.有研究表明，当雷公藤红素浓度为1.7μmol/L时，结肠癌细胞HCT-116细胞的凋亡率为9.87%，浓度增加到7μmol/L时，则凋亡率为17.40%，具有统计学意义，同时，结肠癌细胞HCT-116细胞的细胞核固缩，核内染色质聚集于核膜内侧呈团块或新月状等凋亡形态.与本实验相比较可知，肺癌细胞相对于结肠癌细胞对雷公藤红素更敏感，促进凋亡所需的浓度也更低。

雷公藤红素抗肿瘤的机制是诱导肿瘤细胞凋亡，其机制涉及多种与凋亡相关的信号转导途径参与了疾病的潜在治疗，因此表现出对各种慢性疾病和癌症价值，包括改变细胞周期、上调抗凋亡蛋白等，但其具体的作用机制尚不完全清楚.同时有研究表明，雷公藤红素能促进TNF-α诱导的凋亡抑制因子家族中C-IAP1和C-IAP2的产生，能够抑制许多类型的癌细胞的生长，并且在各种动物模型体内能抑制肿瘤的起始、进展和转移，包括乳腺癌，肺癌，胰腺癌，神经胶质瘤，黑色素瘤以及PCa.到目前为止，没有显著的负面效应被报道.本实验证明，雷公藤红素可以抑制肺癌H727和H1299细胞的活性，使其细胞核发生变化，促进其凋亡，将为抗肿瘤药物的研发和临床应用提供理论依据