东洋纺逆转录试剂盒
12-03
PCR选
东洋纺就
ReverTra Ace qPCR RT Kit
(Code No.FSQ-101)
中文说明书
科研用
TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN
目 录
[1]前言...............................................1
[2]产品内容...........................................2
[3]其他必需品.........................................3
[4]使用方法..........................................4
[5]相关操作步骤......................................5
[6]常见问题..........................................8
[7]相关产品..........................................9
【注意】
本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。
【保存】
[1]前言
ReverTra Ace qPCR RT Kit是基于制作Realtime PCR用模板cDNA的目的而开发的高效率且使用简单方便的逆转录反应试剂盒。本产品采用了本公司高性能逆转录酶ReverTra Ace和作为Realtime PCR目的片段短链cDNA合成的最优化反应成分，能够高效率地合成适用于Realtime PCR的cDNA模板。此外，本产品简化了试剂盒的构成并且拥有快速的反应操作的特点，能够在短时间内简单方便地进行cDNA合成。
※本产品的试剂盒内没有添附Realtime PCR试剂。关于Realtime PCR产品，推荐使用本公司的Realtime PCR用试剂Realtime PCR Master Mix系列。（详情请参考◆本产品特征◆
1．对应各种不同长度目标片段的高效率逆转录
ReverTra Ace qPCR RT Kit采用了最适合于Realtime PCR用cDNA合成的反应缓冲液，和以最恰当比例混合的Primer混合液，对于各种不同长度的目标片段，不用摸索条件就能够进行高效率的逆转录反应。
2．反应时间短、操作简单方便
ReverTra Ace qPCR RT Kit只需要15分钟的逆转录反应，就能够对各种长度的目标片段进行高效率的逆转录反应。此外，在Realtime PCR的过程中，会自动清除抑制反应的残留RNA，无须另外进行RNase H处理。
3．提高了与Realtime PCR试剂的兼容性
ReverTra Ace qPCR RT Kit采用了对于Realtime PCR反应体系的影响程度最小的成分，即使在PCR反应中添加了最多20%液量的逆转录反应液，也能表现出良好的反应曲线（已通过使用本公司的Realtime PCR Master Mix确认）。最适合用于表达量较少的mRNA的高灵敏度检测。
[2]产品内容
◆本产品包含以下几种试剂，每10μl反应体系可使用200次。所有试剂请均保存在-20℃条件下。试剂名
5RT Buffer（Reaction Buffer+MgCl2+dNTPs）
Enzyme Mix（ReverTra Ace reverse transcriptase
+RNase Inhibitor）
Primer Mix（Random Primer+Oligo(dT) Primer）
Nuclease-free Water保存条件-20℃容量400μl-20℃100μl-20℃-20℃100μl1000μl×25RT Buffer
含有反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等5倍浓度的逆转录反应液Buffer。溶解时，可能会出现白色沉淀，但不影响其品质。请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解之后再使用。
Enzyme Mix
含有本公司高性能逆转录酶ReverTra Ace和RNase Inhibitor的混合酶液。-20℃条件下不会冻结。
Primer Mix
含有Random Primer和Oligo(dT) Primer的混合引物，以最恰当的比例混合，对于各种不同长度的目标片段都能进行高效率的逆转录反应。Nuclease-free Water
Nuclease-free级别的灭菌蒸馏水。为避免影响聚合酶的活性，未经过DEPC处理。
[3]其他必需品
◆除本产品之外，请再准备以下几种试剂和仪器。
•Thermal cyclerIncubator
本产品的建议使用温度为37℃、98℃、以及65℃，请准备好符合条件的相关仪器。
•Nuclease-free Water
本产品已添附可使用200次的Nuclease-free Water，此外请再准备一些Nuclease-free Water，以便在稀释模板RNA时使用。推荐使用未经过DEPC处理的Nuclease-free Water。也可以使用经DEPC处理过的水，但残留的DEPC会抑制反应的进行，因此请使用高压灭菌器彻底清除DEPC之后再使用。此外，为防止核酸的混入，用于逆转录反应和PCR反应的Nuclease-free Water，建议和用于其它实验的Nuclease-free Water分开保存，避免共用。•Total RNA
使用本产品，可以把Total RNA直接作为模板使用。从组织、培养细胞等得到Total RNA中，作为表达分析对象的mRNA的含量通常为1-2%。除了进行检测表达量极低的目的基因之外，通常情况下都可以明显地检测到作为模板的Total RNA。
通过AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法等提纯的Total RNA中，混有基因组DNA。对于在检测的目的基因中存在很多假基因的情况，以及跨内含子位置不能设计引物的情况，可能是因为由混入的基因组DNA产生的假阳性信号引起的。请采取必要的措施（如：DNase I等）清除基因组DNA。
•poly(A)+ RNA(mRNA)
利用poly(A)+ RNA和Oligo(dT)杂交后，选择性地分离出仅有poly(A)+末端的mRNA。在提纯过程中浓缩mRNA，是为了在高灵敏度下能够检测mRNA。但是，与Total RNA相比mRNA更容易受到RNase的分解，也不能以ribosomal RNA为内参来进行相对定量。
[4]使用方法
（1）RNA的变性
把RNA在65℃条件下进行5分钟后，立即放于冰上冷却。•在经过以上步骤的处理后，对于容易形成高级结构的RNA可以提高逆转录的效率。•在进行以上步骤处理的时候，请不要添加5×RT Buffer和酶。
（2）反应液的配制反应液组成
Nuclease-free Water
5×RT Buffer
RT Enzyme Mix
Primer Mix
Total volumeup to 10μl2μl0.5μl0.5μl10μl
•除了在本试剂盒内添附的Primer Mix之外，也可以使用基因特异性引物（Gene Specific Primer）。此时，在反应体系中添加的最终浓度为0.5pmol/μl（每10μl反应体系添加5pmol）。
（3）逆转录反应
在37℃条件下，进行15分钟的逆转录反应。
↓
在98℃条件下，进行5分钟的酶失活反应。
↓
反应结束之后，请保存于4℃或者-20℃条件下。在进行Realtime PCR反应时，请在作为模板的反应液内直接添加或者稀释之后添加。•此温度条件是最适合本试剂盒组成成分的条件，一旦改变此温度条件，除了影响酶的活性之外，对引物的退火效率、RNA的清除效率、以及逆转录反应后的酶失活效率等也会产生很大的影响。摸索条件的时候，请一定要基于此温度条件来进行实验。
•把逆转录反应液添加到Realtime PCR反应液内时，请不要超过20%的量。添加过量的逆转录反应液，会降低PCR的反应效率，不能进行准确的定量。•在使用基因特异性引物的情况下，特别是使用相同序列的逆转录引物和PCR引物的时候，在逆转录反应时的非特异性退火是导致PCR非特异性扩增产物产生的原因。此时，提高逆转录反应的温度（至42-50℃）可得到改善。
[5]相关操作步骤
1．Total RNA的DNase I处理
在通过AGPC法等提纯的Total RNA内混有基因组DNA，可能会发生由基因组DNA产生假阳性信号的情况（请参考p3），请根据以下的方法清除基因组DNA。
（1）反应液的配制和反应反应液组成（例）
Nuclease-free Water
Total RNA（
10×DNase I Bufferup to 10μlXμl1μl
0.5μl
10μl（10mM Tris-Cl, pH7.6, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2）RNase-free DNase I（10U/μl）Total volume
配制好以上的反应混合液后，置于冰上反应10~30分钟。
（2）提纯（可使用一般的提纯试剂盒）
在反应液内添加100μl的Nuclease-free Water、100μl的TE饱和苯酚，用vortex使其充分混合后，置于冰上5分钟。
↓
12,000rpm、5分钟的离心后，回收上清液。
↓
添加100μl的氯仿后使其混合。
↓
12,000rpm、5分钟的离心后，回收上清液。
↓
添加100μl的5M醋酸铵、200μl的异丙醇，使其混合后置于-20℃条件下30分钟。
↓
12,000rpm、5分钟的离心后，弃上清液。
↓
在沉淀中加入70%乙醇。
↓
12,000rpm、5分钟的离心后，弃上清液。
↓
在沉淀中加入适量的Nuclease-free Water，使其溶解。
2．Poly(A)+ RNA提纯法
在进行检测表达量较少的遗传基因时，从Total RNA中提取poly(A)+ RNA作为模板使用，可以提高灵敏度。在此介绍一个poly(A)+ RNA提纯法的例子：通过使用Oligo(dT)结合磁珠的专用提纯试剂盒MagExtractor -mRNA-（Code No. NPK-801）的方法。
（1）DNase I反应液的配制和提纯前的处理反应液组成（例）
MagExtractor -mRNA-溶出液
Total RNA（
10×DNase I Buffer
RNase-free DNase I（10U/μl）
Total volumeup to 100μlXμl10μl1μl100μl
配制好以上的反应混合液后，置于冰上反应15分钟。
↓
在反应液内添加400μl的溶解液（含2-巯基乙醇）和800μl的吸附液。（2）反应和提纯
在新的1.5ml离心管内加入250μl磁珠。
↓
使用磁力架Magical Trapper（Code No.MGS-101）或离心机等进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。
↓
添加上述经过事先处理的Total RNA液。
↓
用vortex充分搅拌（至均匀程度）后，在室温下放置10分钟。
↓
进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。
↓
添加1ml的洗净液。
↓
用vortex充分搅拌（至均匀程度）。
↓
进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。
↓
添加1ml的洗净液。
↓
（转下页）
（接上页）
↓
用vortex充分搅拌（至均匀程度）。
↓
进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。
↓
添加1ml的洗净液。
↓
用vortex充分搅拌（至均匀程度）。
↓
进行固液分离（B/F分离）后，弃上清液。
↓
进行离心后，再弃上清液。
↓
添加适量的溶出液。
↓
用vortex充分搅拌（至均匀程度）。
↓
65℃、2分钟。
↓
用vortex充分搅拌（至均匀程度）。
↓
离心。
↓
进行固液分离（B/F分离）后，回收含有poly(A)+ RNA的上清液。• MagExtractor -mRNA-的标准操作，需要反复进行2次上述的提纯。经过2次反复提纯，能够清除1次提纯未能完全清除的rRNA和基因组DNA。通常情况下，
+只需提纯1次，但如需要获取高纯度的poly(A) RNA时，请进行2次提纯。
•关于此提纯法的详细介绍参考MagExtractor -mRNA-附带的使用说明书。
［6］常见问题
1．在Realtime PCR时检测无信号，或者信号出现延迟。
原因
RNA的纯度较低
RNA被降解对策可能是由于配制RNA时残留的杂质抑制了逆转录反应。请重新提纯模板RNA。RNA可能是被混入的RNase降解。请重新配制
RNA。此外，低浓度的RNA保存时，除更容
易被RNase降解外，由于被反应容器吸附，
实际的RNA的量会有所减少。建议避免把使
用过的低浓度RNA冻结保存后再使用，最好
每次使用时直接从高浓度的保存液稀释。
经确认，使用本产品时，添加1pg-2μg范围
的RNA的量都能够进行稳定有效的逆转录反
应。但是由于RNA的种类和品质等的不同，
可以进行反应的RNA的量可能会有所改变。
请适当增减模板RNA的添加量。
改变反应条件会对引物的退火效率、逆转录后的酶失活、模板RNA的清除效率等
多方面产生影响。在进行实验时，请务必要按
照本使用说明书上记载的条件来设定反应温
度。RNA的量过多或者过少反应温度不当
逆转录反应液的添加量过多经确认，使用本产品时，即使在PCR反应液内
添加最多20%的逆转录反应液也能表现出良
好的反应曲线。但是使用不同的PCR试剂，可
能会使表达量降低。请减少逆转录反应液的添
加量。
2．在Realtime PCR时检测到非特异性的信号。
原因对策
发生引物的非特异性退火的使用基因特异性引物进行逆转录时，引物的非情况（使用基因特异性引物特异性退火是在PCR时出现非特异性信号的时）重要因素。提高逆转录反应的温度，可以有效
地提高退火的特异性。请把反应温度设定在
42℃-50℃的范围内。
[7]相关产品
Realtime PCR试剂
品名
Realtime PCR用Master Mix（Probe Assay用）规格1ml×5
1ml×5
1ml×5
1.67ml×3
1.67ml×3Code No.QPK-101QPK-201QPK-212QPS-101QPS-201Realtime PCR Master MixRealtime PCR用Master Mix（SYBR Green Assay用）SYBR Green Realtime PCR Master MixRealtime PCR用Master Mix（SYBR Green Assay用）SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus-Realtime PCR用Master Mix（Probe Assay用）THUNDERBIRD Probe qPCR MixRealtime PCR用Master Mix（SYBR Green Assay用）
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix
配制RNA
的相关试剂
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with gDNA Remover200次FSQ-301
One-step PCR试剂
品名
One-step Realtime PCR用Master Mix
（Probe Assay用）规格500μl×5Code No.QRT-101RNA-direct
Realtime PCR Master Mix
One-step Realtime PCR用Master Mix
（SYBR Green Assay用）
RNA-direct SYBR Green
Realtime PCR Master Mix500μl×5QRT-201
◆详情请浏览本公司中文网页
http://www.bio-toyobo.cn
[制造 • 销售商]
东洋纺（上海）生物科技有限公司
上海市浦东新区张杨路188号汤臣商务中心C座310室邮编：200122
交货期限•订货相关咨询
Tel:021-58794900 Fax:021-58794901
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Tel:021-58794142 Fax:021-58795259
E-Mail:[email protected]://www.bio-toyobo.cn
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