突变体质粒构建-PCR法-2011

实验题目：突变体质粒构建——PCR法

背景与原理：

蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR方法可向目的DNA片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图：

第一轮PCR

产物I

产物II

第二轮PCR

退火

延伸

8个循环后加入

引物1/引物4

本实验拟在某基因编码区（CDS）内，通过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。该基因片段长724bp，上下游分别以XhoI和BamHI两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS。此基因内部含有一个EcoRI酶切位点，我们通过PCR

法诱

变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI

单酶切验证突变是否成功。具体设计如下：

仪器、试剂及药品配方：

1. 仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作

台，冰箱 2. 试剂及配方：

2.1 试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电

泳marker 2.2 PCR反应体系：

primex 模板

上游引物（5μM） 下游引物（5μM） 水

2.3 primex配制：

primex

Taq酶

10×Taq酶buffer dNTP（2.5μM） 水

2.4 DNA电泳buffer（TAE）：

工作液（1×） 40mM Tris-乙酸

储存液（50×）

242g Tris/57.1ml冰乙酸

12.5μl 1μl 2μl 2μl 7.5μl

0.125μl 2.5μl 2μl 7.875μl

1 mM EDTA

2.5 LB液体培养基（1000ml）

蛋白胨 酵母抽提物 NaCl

2.6 LB固体培养基（100ml）

蛋白胨 酵母抽提物 NaCl 琼脂粉

3. 实验方法：

3.1 PCR制备突变体片段： 3.1.1第一轮PCR反应体系：

100ml 0.5M EDTA（pH8.0）

10g 5g 5g

1g 0.5g 0.5g 1g

1

7221

反应条件：

94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃

3.1.2 第二轮PCR反应体系：

primex

μl

产物I

3μl

2～12.5

1min 30S 1min 30S 5min

30循环

产物II

3μl

引物1（5μM） 引物4（5μM） 水

2～

2μl 2μl 补足至25μl

注：引物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。 反应条件：

94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃

3.2 凝胶回收： a. 配制琼脂糖凝胶； b. DNA琼脂糖凝胶电泳；

c. 紫外灯下截取相应的DNA片段凝胶，置于1.5ml dorf 管内；

d. 每管加入500μl 溶液A，55℃水浴融化10min，其间可振荡助融2-3次； e. 融化后，每管加入15μl 溶液B，混匀，加入离心柱； f. 离心12000rpm，30s；

g. 弃下管液，每管加入500μl 溶液C，离心12000rpm，30s；

h. 重复步骤g（弃下管液，每管加入500μl 溶液C，离心12000rpm，30s） i. 弃下管液，离心12000rpm，30s；

j. 将离心柱置于新的dorf管中，室温敞开离心管盖2-3min，每管加入25μl 溶液D，室温

放置2min；

k. 离心12000rpm，1min。 3.3 酶切体系：

3.3.1构建质粒酶切体系：

1min 30S 1min 30S 5min

35循环（第8个循环后暂停加入引物）

3.3.2酶切验证体系：

3.4 连接体系：

载体（100ng） 片段（68ng） T4连接酶 10×buffer 水

3.5 制备感受态： a.

b. c. d. e. f.

μl μl 0.5μl 1μl 补足至10μl

取培养的菌液1ml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600＝0.35（可凭经验）；

将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml； 离心，4℃ 4000rpm，10min；

弃上清，每管加入10ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀； 离心，4℃ 4000rpm，10min；

弃上清，每管加入2ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀，再分别加入2ml灭过菌的40％甘油，混合均匀； g. 按每管150μl分装，-80℃贮存备用。 3.6 转化： a. b. c. d. e. f.

超净工作台内，将连接体质粒加入感受态细胞，冰浴30min； 热击，42℃，90秒； 冰浴1～2min；

超净工作台内，加入800μl LB液体培养基，振荡预培养50min； 离心，8000 rpm，1.5min，弃上清，余100μl左右，吹散沉淀； 涂布LB固体培养基平板，37℃正置培养1h；

g. 翻转平板倒置培养过夜。 3.7 小提质粒：

a. 离心收集菌体，12000rpm，30S；

b. 弃上清，150μl 溶液I（25mM Tris-Cl，10mM EDTA）重悬菌体；

c. 加入150μl 溶液II（2％SDS：0.4M NaOH ＝ 1：1）轻混；注：溶液II现用现配。 d. 加入150μl 溶液III轻混；

乙酸钾（5M） 冰乙酸 水

e. 离心，12000rpm，5min；

f. 收集上清至新管，加入等体积酚：氯仿（1：1），振荡； g. 离心，12000rpm，5min；

h. 移上清至新管，二倍体积无水乙醇沉淀20min； i. 离心，12000rpm，10min；

j. 弃上清，室温干燥，20μl TER溶解； k. 电泳验证。

60ml 11.5ml 28.5ml

日程安排：

2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

图1：产物I 电泳

2000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→图2：产物II 电泳

←446bp

←314bp

2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

←446bp

2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

←314bp

图3：产物I 电泳回收 2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

图4：产物II 电泳回收

2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

←

736bp

←736bp

图5：全长突变片段电泳

6623bp→ 4254bp→图6：全长突变片段电泳回收 2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

图8：片段醇沉回收

←5427bp

←736bp

图7：载体酶切电泳

←5427bp

6623bp→ 4254bp→

←5427bp

2000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→←736bp

图9：载体酶切电泳回收

←5918bp

2000bp→ 1000bp→ 750bp→ 500bp→ 250bp→ 100bp→

图10：BamHI/XhoI双酶切验证

←6163bp

2000bp→1000bp→750bp→500bp→250bp→100bp→图12：EcoRI单酶切阴性结果

←245bp

图11：EcoRI单酶切阳性结果

注意事项与建议：

1. 实验准备工作一定要提前做好。

2. 每一步实验都需要电泳验证，得到阳性结果以后才可以进行下一步实验。 3. 具体实验步骤，如酶切时间，醇沉时间等可以灵活掌握。

思考题：

1. PCR原理；

2. 限制性内切酶原理及双酶切buffer选择问题； 3. 转化原理。 参考文献：

分子克隆实验指南 (第三版) 〔美〕J．萨姆布鲁克 D．W．拉塞尔著 黄培堂等译 北京 科学出版社 2002.8