影响扯根菜愈伤组织形成的因素研究
第28卷第4期
Vol.28No.4西华师范大学学报(自然科学版)
JournalofChinaWestNormalUniversity(NaturalSciences)2007年12月
Dec.2007
文章编号:1673-5072(2007)04-0278-04
影响扯根菜愈伤组织形成的因素研究
王光碧,杨 军
1
1,2
,王立强
1
(1.西华师范大学生命科学学院,四川南充 637002;2.西华师范大学珍稀动植物研究所,四川南充 637002)
测试了不同的外植体,不同培养基及不同激素种类及浓度对扯根菜愈伤组织诱导的影响,结果表明:不同摘 要:培养基组合所诱导的愈伤组织状态不同,但诱导率均高于90%;光照苗茎段在WPM+NAA2mg/L+6-BA(1.5mg/L≤[6BA]≤3)培养基上,所诱导的愈伤组织较好:水样化程度低,诱导时间相对短,生长良好而快速.本实验为进一步建立扯根菜的间接再生体系提供了依据.
关键词:扯根菜;愈伤组织;植物激素
中图分类号:Q994.6 文献标识码:A
扯根菜(PenthorumchinensePursh),为虎耳草科扯根菜属植物,在民间作为草药使用,具有清热、利湿、解毒、活血、平肝、健脾等作用囊炎、脂肪肝等小
[4]
[3]
[1,2]
.以扯根菜为主要原料制成的“古蔺肝苏(颗粒、胶囊)”可以用于治疗肝炎、胆
,而且扯根菜还可以食用,因此深受人们的喜爱.但是扯根菜为喜阴喜湿植物,生长地域狭
,因此有必要通过遗传转化手段对其性状进行改良,而建立遗传转化体系的基本前提是获得优良的愈
伤组织和建立高频率的植物离体再生体系.本文对扯根菜愈伤组织的诱导条件进行探索.
1 材料与方法
西华师范大学生命科学学院遗传实验室提供的扯根菜组培苗.先将其切成1-2cm小段(含腋芽),接入到无激素MS培养基中培养至成苗(重复两代以消除激素背景).然后用同样的方法将茎段分别于光照和黑暗条件培养至成苗,获得的苗分别为光照苗和黄化苗.切取黄化苗和光照苗茎节段(尽量不带腋芽),置于不同的培养基组合中诱导愈伤组织.培养基选用MS基本培养基,附加2mg/LNAA和不同浓度的6-BA或KT,另附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L,将pH值调至5.8-6.2,于121℃灭菌15min待用.外植体接种后置于黑暗培养,培养温度(25±2)℃,25d后统计愈伤组织诱导率(以直径大于0.5cm为出愈伤组织).愈伤组织诱导率计算公式如下:愈伤组织诱导率=(诱导出愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数)×100.
2 结果和分析
外植体接入培养基后,短时间内迅速褐化,培养8d左右褐化程度逐渐减轻,部分茎段的切口处开始膨大,12d左右在切口表面出现肉眼可见的愈伤组织(见图1A).25d后愈伤组织形成率统计结果见表1-表4.2.1 不同外植体对诱导愈伤组织的影响
本实验采用黄化苗和光照苗的茎段作外植体,在相同的激素配比下,从愈伤组织的生长速度和形态来看:由光照苗茎段诱导形成的愈伤组织较黄化苗茎段诱导形成的愈伤组织生长速度更快,状态更致密,许多呈瘤状突起;光照苗茎段在分裂素为2.5mg/L的部分WPM培养基中出现了芽;可见,光照苗茎段较之黄化苗茎段更适合作为愈伤组织诱导的外植体.
收稿日期:2007-07-30
基金项目:四川省青年科技基金资助项目(05ZQ026-017);四川省重点学科建设项目(sz00420)作者简介:王光碧(1982-),女,四川简阳人,西华师范大学生命科学学院硕士研究生,主要从事组织培养方面的研究.通讯作者:杨 军(1973-),男,重庆忠县人,西华师范大学生命科学学院副研究员,博士,主要从事细胞生物学和遗传学教学研究工作.
2.2 不同培养基对诱导愈伤组织的影响
本实验采用2种基本培养基(BPM),通过相同条件下的比较发现:WPM诱导出的愈伤组织水样5和W化程度较B在同一时间内WPM培养基形成的愈伤组织褐化程度比B5低,但硬度大,瘤状突起更多;5培养更低(见图1A,D),而生长速度更快.因此认为WPM培养较B5更适合诱导扯根菜愈伤组织.
表1 黄化苗茎段在WPM培养基上诱导愈伤组织情况Tab.1 CallusindcuctionofalbinoplantsegmentsonWPMmedium
激素(mg/L)
NAA
[1**********]222
6-BA0.51.01.522.533.5-------KT--- -- --0.511.522.533.5
接入外植体数
[***********]3234394235
形成愈伤组织外值体数
27
[***********]32363833
诱导率(%)
90.093.8
94.392.692.594.391.993.197.193.894.192.390.594.3
愈伤组织状态
大量根毛,高度水样化,白色大量根毛,高度水样化,白色
少量根毛,白色较密较紧密,黄绿色紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色
高度紧密,黄绿色
大量根毛,高度水样化,白色大量根毛,高度水样化,白色少量根毛,出现芽点,较密较紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色
表2 光照苗茎段在WPM培养基诱导愈伤组织情况Tab.2 CallusindcuctionofnormalplantsegmentsonWPMmedium
激素(mg/L)
NAA6-BA[1**********]222
0.51.01.522.533.5-------KT0
-- -- --0.511.522.533.5
接入外
植体数[***********]3639393936
形成愈伤组织外值体数
[***********]3735383733
诱导率(%)
94.4
95.694.994.997.094.992.395.294.997.297.410094.991.7
状态
大量根毛,高度水样化,白色
大量根毛,高度水样化,白色少量根毛,白色较密
较紧密,黄绿色,瘤状突起
部分长出芽,紧密,黄绿色,瘤状突起高度紧密,黄绿色,瘤状突起高度紧密,黄绿色,瘤状突起大量根毛,高度水样化,白色大量根毛,高度水样化,白色少量根毛,出现芽点,较密较紧密,黄绿色,瘤状突起
部分长出芽,高度紧密,黄绿色,瘤状突起高度紧密,黄绿色,瘤状突起高度紧密,黄绿色,瘤状突起
2.3 不同激素配比对诱导愈伤组织的影响
本实验采用同一NAA浓度(2mg/L)与不同浓度的分裂素(6-BA和KT)配比,对愈伤组织诱导的影响作了研究,通过上述4组实验的对比发现:
含2种分裂素的培养基诱导愈伤组织能力差别不大,诱导率均高于90%,且都随着分裂素浓度的升高根毛数逐渐减少,愈伤组织的状态由水样化向紧密化转变,颜色由白色逐渐变成黄绿色.但不同的分裂素浓度对愈伤组织形成的状态影响较大:当分裂素浓度为2mg/L左右时时形成黄绿色有瘤状突起的愈伤组织.1
素浓度为2.5mg/L时,有部分培养基组合长出了芽(图1C).由此,诱导扯根菜愈伤组织的最适分裂素范围为1.5-2.5mg/L之间.
表3 黄化苗茎段在B5培养基上诱导愈伤组织情况
Tab.3 CallusindcuctionofalbinoplantsegmentsonBedium5m
激素(mg/L)
NAA
[1**********]222
6-BA0.51.01.522.533.5-------KT0-- -- --0.511.522.533.5
接入外植体数
[***********]3232292425
形成愈伤组织外值体数
29
[***********]30292323
诱导率(%)
93.590.0
91.994.396.710090.393.390.690693.810095.892.0
状态
大量根毛,高度水样化,白色大量根毛,高度水样化,白色
少量根毛,白色较密较紧密,黄绿色紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色
高度紧密,黄绿色
大量根毛,高度水样化,白色大量根毛,高度水样化,白色少量根毛,出现芽点,较密较紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色
表4 光照苗茎段在B5培养基上诱导愈伤组织情况Tab.4 CallusindcuctionofalbinoplantsegmentsonBedium5m
激素(mg/L)
NAA6-BA[1**********]222
0.51.01.522.533.5-------KT0-- -- --0.511.522.533.5
接入外
植体数[***********]4138393932
形成愈伤组织外值体数
[***********]3936383830
诱导率(%)
94.4
97.490.095.393.093.590.99410095.194.797.497.493.8
状态
大量根毛,高度水样化,白色
大量根毛,高度水样化,白色少量根毛,白色较密
较紧密,黄绿色,瘤状突起部分长出芽,紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色,瘤状突起高度紧密,黄绿色,瘤状突起大量根毛,高度水样化,白色大量根毛,高度水样化,白色少量根毛,出现芽点,较密较紧密,黄绿色,瘤状突起部分长出芽,高度紧密,黄绿色高度紧密,黄绿色,瘤状突起高度紧密,黄绿色,瘤状突起
3 讨 论
在植物组织培养中,由于外植体内源激素含量的不同,使得所用培养基的种类,以及培养基中激素的种类,浓度等对愈伤组织的诱导和植物器官的分化都起着重要的调节作用
[6]
.本试验中所用的细胞分裂素种
类对扯根菜愈伤组织诱导的影响不是很明显,但在分裂素浓度低于1.5时出现了根毛.可能的原因是不同外植体诱导愈伤组织时对培养条件的要求不同,尤其是对外源生长调节物质的种类和浓度的要求差异很大.而在45d后分裂素为2.5的部分培养基上长出了芽,原因可能是此类培养条件有利于一步成苗,具体原因还有
第28卷第4期王光碧,等:影响扯根菜愈伤组织形成的因素研究
[7]
281.
在差异.因此对不同外植体进行组织培养时所加外源激素的种类,浓度和组合必须通过实验来确定
本试验WPM培养基诱导的愈伤组织水样化程度较B5低,但硬度大,瘤状突起更多,且外植体
褐化所经历时间延长.这可能与培养基中无机盐的成分和含量的不同有很大关系
[8]
.
由于光照苗茎段容易褐化,因此把茎段处理成黄化苗,以期能诱导不易褐化的愈伤组织.但结果发现光照苗茎段诱导形成的愈伤组织较黄化苗茎段诱导形成的愈伤组织生长速度更快,状态更致密、许多愈伤呈瘤状突起.这可能是由于不同的外植体中所含的内源细胞分裂素与生长素的绝对含量和相对比值不同
[9]
;也可能是由于黄化苗代谢水
平低,缺乏合成活动的物质和能量基础,蛋白质水
[10]
平低,而影响了其植物生长活动.且在试验过程中发现光照苗茎段在分裂素为2.5mg/L的部分WPM培养基中出现了芽,可能的原因一是在切茎段时可能带有芽点,二可能是一步成苗的现象.具体原因还有待进一步研究.因而,选择合适的外植体是非常重要的.
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CallusInductionofPenthorumChinensePursh
WANGGuang-bi,YANGJun,WANGLi-qiang
(1.CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong637002,China;
2.InstituteofRareAnimalsandPlants,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong637002,China)
1
1,2
1
Abstract:TheconditionsforcallusinductionofPenthorumchinensePurshwereoptimizedsuchasexplants,medi-um,plantgrowthregulatonandtheconcentration.Theresultsshowedthatcallusinducedfromdifferentcombination
ofplantgrowthregulatorshaddifferentgrowthstate,alltheinductionrateswererecordedasabove90%.Callusin-ducedfromstemsegementexplantsonWPMmediumplusNAA2mg/Land6-BA(1.5mg/L≤[6-BA]≤3.0mg/L)wasmoresuitable.Suchmediumcallushaslowwaterlevel,ashorttimeofinduction,growthwellandrapidly.TheresearchhasprovidedthebasefortheestablishmentofindirectplantregenerationsystemofP.chinensePursh.Keywords:PenthorumchinensePursh;callus;plantgrowthregulator