一种新型Zn2+近红外荧光探针的研究
2007年第65卷
第13期, 1229～1233
化 学 学 报
ACTA CHIMICA SINICA
V ol. 65, 2007 No. 13, 1229～1233
·研究论文·
一种新型Zn 2＋近红外荧光探针的研究
唐友云 罗春花 吴朝阳* 沈国励 俞汝勤
(湖南大学化学化工学院 化学生物传感与计量学国家重点实验室 长沙 410082)
摘要 Zn2＋是多种酶和转录因子的必要成分, 在生物体内起着重要的作用, 检测Zn 2+具有十分重要的生物学意义. 我们合成了一种新型近红外荧光探针TAEA-IR-780, 该探针通过配位作用与Zn 2＋结合后, 荧光显著增强. 通过质谱和氢谱对该探针进行了表征, 并探讨了pH 值、其它金属离子对Zn 2＋检测的影响. 该探针的激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 可避免对生物活体的损伤, 同时生物体内常见的金属离子对其干扰较小. 该探针对Zn 2＋的检测下限达1.0× 10－9 mol•L－1, 具有较高的检测灵敏度. 关键词 近红外; 荧光探针; Zn2＋
A Novel Near-infrared Fluorescent Probe for Zn2＋
TANG, You-Yun LUO, Chun-Hua WU, Zhao-Yang * SHEN, Guo-Li YU, Ru-Qin
(State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan
University , Changsha 410082)
Abstract Zn 2 is an essential component for many enzymes and transcription factors, in which it plays structural or catalytic roles, so its detection is of great biological significance. The development of novel
＋
near-infrared fluorescent probe for Zn2, TAEA-IR-780, was described in this paper, which was obtained by directly attaching an acceptor, tris(2-aminoethyl)amine (TAEA), to a near-infrared fluorophore IR-780. The excitation and emission wavelengths of the TAEA-IR-780 are 683 and 750 nm, respectively, and its fluores-＋
cent intensity increases with the addition of Zn2 under physiological condition (pH＝7.4) and the detection
－－
limit reaches 1.0×109 mol•L1. Moreover, the fluorescent intensity of TAEA-IR-780 does not increase no-＋＋
ticeably in the presence of other biologically important cations such as Ca2 and Mg 2. The results show that the probe can not only effectively minimize cell damage and autofluorescence by excitation light but
＋
also afford sufficient sensitivity and selectivity for the biological detection of Zn2.
＋
Keywords near-infrared; fluorescent probe; Zn2
＋
锌是一种重要的人体必需的微量元素(日需量约10～15 mg), 广泛地分布于人体的细胞和体液中, 是人体内200多种酶的组成成分, 直接参与体内细胞生长发育、生殖和组织修复等各种生命代谢过程. Zn2＋在细胞的生命活动中起着非常重要的作用, 在基因转录、金属酶催化、神经传递等过程中都有Zn 2＋的参与[1]. 据文献报道, 体内缺少了Zn 2＋会导致免疫系统受损、免疫功能
* E-mail: [email protected]
缺陷等一系列疾病的产生; Zn2＋还能够选择性地诱导与暂时性大脑局部缺血[2]、癫痫[3]、脑损伤[4]等急性病相关的神经元细胞死亡. 尽管有许多报道都描述了Zn 2＋ 在生物体系内的重要性, 但是它的作用机制还不是十分明确. 随着对Zn 2＋ 在生命活动中的作用认识越来越深, 细胞内Zn 2＋的研究已成为化学、生物学和临床医学等学科重要的前沿热点研究课题.
Received December 15, 2006; revised January 12, 2007; accepted March 19, 2007. 国家自然科学基金(No. 20205004)和教育部科学技术研究重点(No. 106122)资助项目.
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近年来, 人们开始研究细胞内Zn 2＋的测定方法和技术, 先后建立和发展了锌离子传感器、Zn 2＋荧光探针、核磁共振和微电极等多种方法. Zn2＋荧光探针法通常具有选择性好、灵敏度高、简便快捷等特点, 因而得到了迅速的发展, 是目前最常用的一种方法. 其中应用最广泛的是由Frederickson 等[5]研究制备的N -(6-甲氧基-8-喹啉)-p -甲苯磺胺(TSQ)及其衍生物[6,7]. Zinquin是其中的衍生物之一, 已用于活体细胞内Zn 2＋的检测[6]. 尽管这些基于喹啉的荧光探针都非常有用, 但是它们的激发波长都在紫外区, 检测过程对活体细胞的损伤较大, 同时也不能避免来自生物体本身的自发荧光, 因而并非理想的荧光探针. Hirano 等
[8,9]
先后合成了ZnAF-1,
ZnAF-2, ZnAF-1F, ZnAF-2F 等荧光探针, 经过不断改进, 在一定程度上改善了紫外光对活体细胞的损伤问题(激发波长492 nm, 发射波长 515 nm), 使活体细胞内的锌离子探测成为可能.
近红外荧光探针发射波长在700～1200 nm范围内, 具有较小的辐射能, 而且在该波长范围内生物分子自身荧光较弱, 可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度, 因而受到很多学者的重视. 本文以IR-780为原料, 合成了一种用于检测Zn 2＋的新型近红外荧光探针, 可避免活体细胞的损伤, 降低生物体自身的荧光背景, 为进一步改善Zn 2＋的活体检测提供了可能.
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
FL3-P-TCSPC 荧光检测仪(美国JY 公司), 激发/发射检测狭缝为5.0 nm/5.0 nm.
IR-780 (98%, Aldrich), TAEA [三(2-氨乙基) 胺, 98%, Aldrich], HEPES (羟乙基呱嗪乙硫磺酸, 98%, Al-drich), ZnSO4•7H2O (99.5%, 天津市大茂化学试剂厂), 其余试剂均为分析纯. 1.2 溶剂的纯化和干燥
量取50 mL的溶剂N , N -二甲基甲酰胺(DMF), 用5 g KOH干燥10 h之后, 减压蒸馏, 5 mL初始馏分不回收, 得到纯净无色的DMF 溶剂, 并加入5 g KOH干燥待用. 1.3 IR-780的TAEA 衍生物(TAEA-IR-780)荧光探针
的合成
TAEA-IR-780的合成如图式1所示. 称取IR-780 40 mg, 量取TAEA 70 μL 、无水DMF 10 mL, 加至 100 mL 的三颈烧瓶中, 升温至80 ℃, 在N 2氛围下搅拌反应4 h. 冷却后, 减压蒸馏, 得蓝黑色固体. 将该固体溶解在 CH 2Cl 2中, 以V (CH3CH 2OH) ∶V (CH2Cl 2) ＝1∶14的混合溶剂为洗脱剂
, 过碱性Al 2O 3 柱, 收集蓝色组分. 减
图示1 TAEA-IR-780的合成
Scheme 1 Synthesis of TAEA-IR-780
压蒸馏后得蓝色固体, 再次以V (CH3CH 2OH) ∶ V (CH3COOCH 2CH 3) ＝1∶4的混合溶剂为洗脱剂过碱性Al 2O 3柱进行纯化, 减压蒸馏后, 得蓝色固体. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 0.9～1.8 (m, 38H), 2.3 (s, 2H), 2.45 (s, 2H), 3.4～3.8 (m, 4H), 4.0～4.3 (m, 3H), 5.3 (s, 3H), 5.6～5.8 (m, 1H), 6.9～8.2 (m, 8H); ESI＋-MS: calcd 649.97, found 651.3.
1.4 TAEA-IR-780荧光探针对Zn 2＋的荧光响应 1.4.1 TAEA-IR-780贮备液的配制
称取7.5 mg TAEA-IR-780, 溶于0.965 mL二甲亚砜(DMSO)中, 配成10 mmol•L－1的贮备液备用. 取60 μL 10 mmol• L－1的贮备液, 稀释至10 mL, 得0.06 mmol•L－1待用液.
1.4.2 羟乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液的配制
称取HEPES 2.38 g, NaNO3 0.085 g, 配制100 mmol•L－1的HEPES 缓冲液(pH＝7.4) 备用. 1.4.3 测量过程
取2.8 mL的HEPES (pH＝7.4, I ＝0.1), 加入0.06 mmol•L－1的待用液50 μL (TAEA-IR-780的最终浓度为1.0 μmol•L－1), 不同浓度的Zn 2＋溶液 50 μL, 检测荧光强度. 测量荧光强度时, 激发波长为683 nm, 狭缝宽度为5.0 nm/5.0 nm.
2 结果与讨论
2.1 TAEA-IR-780的荧光光谱特征
IR-780是一种三碳菁近红外荧光染料, 其激发波长为780 nm, 发射波长为804 nm, stokes位移较小. 根据Peng 等[10]报道, 当三碳菁被含有氨基的基团取代后, 其吸收波长将会蓝移, stokes位移将会增大, 其原因为分子内电荷转移(ICT). 我们用多氨基的TAEA 基团取代
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了IR-780分子的氯原子, 合成了TAEA-IR-780并研究了其荧光特性. 图1为TAEA-IR-780的荧光光谱图, 从图中可以看出TAEA-IR-780的吸收波长出现了较大蓝移, 最大激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 其stokes 位移亦比IR-780明显增大(为67 nm). 这些结果与Peng 等[10]的报道氨基取代对IR-780分子的荧光光谱的影响基本一致, 而且增大的stokes 位移亦为Zn 2＋的高灵敏检测提供了良好的保障
.
图1 TAEA-IR-780的激发和发射光谱
Figure 1 The excitation and emission spectra of TAEA-IR-780
2.2 测定原理
TAEA 是一个强的金属配位基团, 在 TAEA-IR- 780溶液中加入Zn 2＋
后, TAEA基团与Zn 2＋
配位结合, 假设Zn 2＋
与TAEA-IR-780配位生成m ∶n 的配位化合物, 可认为Zn 2＋(B)与TAEA-IR-780 (A)反应存在以下平衡:
m B ＋n A ⎯⎯K →A n B m
(1)
K 是配位反应平衡常数. 根据修正的Stern-Volmer 方 程[11]推导出荧光强度信号的改变、
TAEA-IR-780的浓度[A]及Zn 2＋的浓度[B]三者之间的关系可表示如下：
F －F 0
＝K [A]n －1[B]m F
设ΔF ＝F 0－F , 代入上式并取对数得：
lg(ΔF
F
＝lg K ＋(n －1)lg[A ]＋m lg[B ] (2) F 0和F 分别表示空白溶液的荧光强度和加入Zn 2＋后的
荧光强度. (2)式说明：以lg(ΔF
F
) 对lg[B ]作图应是一条 斜率为m , 截距为lg K ＋(n －1) lg[A ]的一根直线. 图2为
实验所得荧光强度变化值对数lg(ΔF 2F
) 与Zn ＋
浓度对数
lg[B ]的函数关系图. 从图中可以看出函数关系曲线为
一直线, 经计算斜率为0.9144, 取整数可得出m ＝
1.
图2 荧光强度变化值对数lg(ΔF /F ) 与Zn 2＋
浓度对数lg[B]的
函数关系图
Figure 2 A plot of lg(ΔF /F ) as a function of the lg[Zn2＋]
假设溶液中游离的TAEA-IR-780浓度[A]f 与其总浓度[A]t 之比为α, 检测到的荧光强度可表示为:
α＝
[A]f
F －F [A]＝0F (3)
t F 0－b
其中F b 是空白缓冲溶液的荧光强度, F 0是TAEA- IR-780与Zn 2＋全部配合以后的荧光强度, F 是实际检测的荧光强度. 由于已得出m ＝1, α与Zn 2＋浓度[B]的关系可表示为:
αn 1－α＝1
nK [A]n －1[B]m
(4)
图3中5条曲线是分别用不同n 值和K 值代入公式(4)计算而得出. 从图中可以看出, m ∶n 为1∶1, K 为9.65×105的曲线与实验数据最为吻合, 可见TAEA-IR- 780与Zn 2＋是通过1∶1配位结合. 根据配位基团TAEA 的分子结构特点, 可推测其与Zn 2＋形成了稳定的四配位化合物, 实现对金属离子的选择性结合. TAEA-IR- 780的配位作用如图式2所示. 该探针的作用机理可能是TAEA-IR-780中与IR-780直接相连的N 原子与金属离子配位致使分子极化状态改变, 从而影响分子内电荷
转移, 导致荧光强度增加. 实验考察了Zn 2＋配位作用对探针的荧光特性的影响, 在１μmol•L－1的TAEA-IR-780溶液中分别加入不同
浓度的Zn 2＋溶液并测量了其荧光发射光谱(图4). 从图
中可以看出, Zn2＋浓度在(1.0×10－9～1.66×10－5) mol•L－1
范围内, 荧光强度随Zn 2＋浓度的增加而明显增加. Zn2＋
检测下限可达1.0×10－9 mol•L－1 (由空白值的3倍标准偏差确定), 显示了较高的检测灵敏度.
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图3 相对荧光强度α对lg[Zn2＋]的关系曲线
Figure 3 Relative fluorescence intensity α as a function of lg[Zn2＋]
The curves fitting the experimental data were calculated from Eq. (4). (1) m ∶n ＝3∶1, K ＝8.98×1017; (2) m ∶n ＝2∶1, K ＝9.31×1011; (3) m ∶n ＝1∶1, K ＝9.65×105
; (4) m ∶n ＝1∶2, K ＝9.64×1011
; (5) m ∶n ＝1∶3, K ＝ 1.93×1018 ■
Data points experimentally obtained
图式2 TAEA-IR-780与Zn 2＋的配位
Scheme 2 The coordination of TAEA-IR-780 and Zn2＋
2.3 pH值对荧光强度的影响
TAEA-IR-780作为Zn 2＋
的选择性荧光探针主要基于TAEA 的配位作用, 而溶液pH 值的大小会影响TAEA 氨基的离解状态, 改变TAEA 的配位能力, 进而影响TAEA-IR-780的荧光响应. 我们测定了不同pH 值的HEPES 缓冲溶液(100 mmol•L－1, I ＝0.1) 对荧光强度的影响(图5). 结果显示, 在中性pH 范围, pH值对TAEA-IR-780的荧光响应的影响较小, 在pH ＝7左右时, 相对荧光强度具有最大值. 而生物活体样品的检测一般在pH ＝7.4的条件下进行的, 因此选择 pH＝7.4的HEPES 缓冲溶液来进行所有的实验
.
图4 TAEA-IR-780 与不同浓度的Zn 2＋作用后的荧光光谱图 Figure 4 Fluorescence emission spectra of TAEA-IR-780 in the presence of different concentration of Zn2＋
(1) 0; (2) 1.0×10－
9; (3) 1.0×10－
8; (4) 1.0×10－
7; (5) 2.0×10－
7; (6) 4.0×
10－
7; (7) 1.0×10－
6; (8) 8.33×10－
6; (9) 1.66×10－
5 mol•L
－1
(λex ＝
683 nm)
图5 pH 值对荧光强度的影响
Figure 5 Effect of pH on the fluorescence intensity
I F /F0＝F /F 0, F 0 was the blank value of fluorescent intensity; F was fluorescent
intensity after adding Zn2＋
(the final concentration of Zn 2＋
was 1 μmol•L－
1)
2.4 干扰测定
为了研究该荧光探针的选择性能, 考察了一系列生物体系中常见金属离子的干扰情况, 检测结果如图 6所示. 由于与TAEA 的配位能力很弱的原因, 在Na ＋, K ＋, Ca2＋, Mg2＋等碱金属和碱土金属离子的存在下, 该荧光探针都没有明显的响应. 而在过渡态金属阳离子Co 2＋和Ni 2＋的存在下, 荧光强度有少量的增加, 其原因可能是TAEA-IR-780可与这些过渡态金属阳离子亦可形成配合物有关, 但其增加值显著小于探针对Zn 2＋的响应值. 而Fe 3＋, Mn2＋和Cu 2＋等离子的存在会引起荧光强度下降, 可能是这些金属离子可引起荧光淬灭. 结果显示该探针对Zn 2＋具有良好的选择性, 抗干扰能力强, 有望用于生物活体检测.
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图6 不同金属阳离子对Zn 2＋检测的荧光干扰图
Figure 6 The relative fluorescence intensity of 1 μmol•L－1 TAEA-IR-780 in the presence of various cations
The data was measured at pH 7.4 (100 mmol•L－
1 HEPES buffer, I ＝0.1). 1.
none; 2. 1 μmol•L－
1 Zn2+; 3. 5 mmol•L－
1 Na+; 4. 5 mmol•L－
1 K +; 5. 5
mmol•L－
1 Ca2+; 6. 5 mmol•L－
1 Mg2+; 7. 1 μmol•L－
1 Mn2+; 8. 1 μmol•L－
1
Fe 2+; 9. 1 μmol•L－
1 Fe3+; 10. 1 μmol•L－
1 Co2+; 11. 1 μmol•L－
1 Ni2+; 12. 1
μmol•L－
1 Cu2+; 13. 1 μmol•L－
1 Zn2+＋5 mmol•L－
1 Na+; 14. 1 μmol•L－
1 Zn2+
＋5 mmol•L－
1 K+; 15. 1 μmol•L－
1 Zn2+＋5 mmol•L－
1 Ca2+; 16. 1 μmol•L－
1
Zn 2+＋5 mmol•L－
1 Mg2+
3 结论
合成了一种检测Zn 2＋的近红外荧光探针, 其激发波长为683 nm, 发射波长为750 nm, 可避免对活体细胞的损伤, 同时也可降低背景荧光干扰, 其检测下限可达1.0×10－9 mol•L－1. 在pH ＝7.4的生理环境下, 该探针对多种生物体系内常见金属阳离子的抗干扰能力强, 具有检测活体细胞内Zn 2＋的可能性, 在活体细胞内的检测应用正在进一步的研究中.
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