微生物实验报告
高效脱酚菌的分离与筛选
一、 目的要求
学习并掌握分离纯化微生物的基本技能和筛选高效降解菌的基本方法。 二、 基本原理
环境中存在各种各样的微生物,其中某些微生物以无机污染物作为其生长所需的能源、 碳源或氮源,从而使有机污染物得以降解。 采样后,在以苯酚为唯一碳源的培养基中,经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定,可筛选出高效降解菌。 三、 材料与仪器 1. 培养基
脱酚菌分离培养基:①蛋白胨0.25g ,蛋白胨0.25g ,磷酸氢二钾0.05g ,硫酸镁0.025g ,蒸馏水 500mL,调pH7.2~7.4,固体培养基添加2%琼脂
②葡萄糖0.25g 蛋白胨0.25克,蛋白胨0.25g ,磷酸氢二钾0.05g ,硫酸镁0.025g ,蒸馏水 500mL,调pH7.2~7.4,固体培养基添加2%琼脂 试剂
苯酚标准溶液:称取分析纯苯酚5.0g ,溶于蒸馏水中,稀释至1000mL ,摇匀。此溶液每毫升含苯酚5mg 。取此溶液10mL ,移入另一100ml 容量瓶,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。用K2CrO4标准溶液对此溶液的酚浓度进行标定。
四硼酸钠饱和溶液:称取Na2B4O7 40g,溶于1L 热蒸馏水中,冷却后使用,此溶液pH 为10.1。 3% 4-氨基安替比林溶液:称取分析纯4-氨基安替比林3g ,溶于蒸馏水,并稀释至100mL ,置于棕色瓶中,冰箱保存,可用两周。
2%过硫酸胺溶液:取化学纯过硫酸胺2g ,溶于蒸馏水,并稀释至100mL ,冰箱保存,可用两周。
仪器及其他工具
恒温振荡器、恒温培养箱、离心机、分光光度计、玻璃珠、锥形瓶、培养皿等 实验步骤 富集培养
采集活性污泥、生物膜或土样,接种于装有50ml 液体培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中,30℃震荡培养。待菌生长后,用无菌移液管吸取1ml 转至另一个装有50ml 液体培养基并加适量苯酚的三角瓶中。如此连续转接2-3次,每次所加的苯酚量适当增加,最后可得脱酚菌占绝对优势的混合培养物。 ①第一次富集纯化:0.5ml 苯酚
2. 平板分离和纯化
(1)用无菌移液管吸取经富集培养的混合菌液0.1ml ,注入9.9ml 无菌水中,充分混匀,并继续稀释到适当浓度。
(2)取最后三个稀释管,分别各自管中吸取稀释菌液,滴一滴(约0.05ml )于固体平板中央,每格稀释度做2-3个重复。
(3)用无菌玻璃刮棒把滴加在平板上的菌液推平,盖好皿盖。室温放置,待接种菌液被培养基吸收后,倒置于30℃恒温箱,培养1-2d 。
(4)挑选不同形态的菌落,在含适量酚的固定平板上划线纯化。平板倒置于30℃恒温箱,
培养1-2d 。
3. 转接斜面 将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的试管斜面,30℃恒温箱培养24h 。 4. 降解试验 用接种环取各斜面菌苔一环,分别接种于100ml 液体培养基中,30℃震荡培养22-24h 。 5. 测定含酚量 (1)绘制标准曲线。取100ml 容量瓶7只,分别加入100mg/L苯酚标准溶液0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml 。于每只容量瓶中加入四硼酸钠饱和溶液10ml ,3%4-氨基安替比林溶液1ml ,再加入四硼酸钠饱和溶液10ml ,2%过硫酸铵溶液1ml ,然后用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。放置10min 后将溶液转至比色皿中,在560nm 处以试剂空白为参比读取吸光度。根据吸光度和苯酚标准溶液的用量,绘制标准曲线。 (2)取经降解的培养液30ml ,离心。
(3)移取上清液10ml 于100ml 容量瓶中,加入四硼酸钠饱和溶液10ml ,3%4-氨基安替比林溶液1ml ,再加入四硼酸钠饱和溶液10ml ,2%过硫酸铵溶液1ml ,然后用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。同时做空白对照。
(4)放置10min 后用分光光度计测定吸光度。
(5)由测得的吸光度和绘制的标准曲线查得酚的毫克数。 (6)计算含酚量。 6. 革兰氏染色 (1)
五、实验安排 (一)、准备工作
1. 培养基:脱酚菌分离培养基 2. 试剂: 苯酚标准液 四硼酸钠饱和溶液
3%4-氨基安替比林溶液 2%过硫酸铵溶液
3. 其他:移液管等
无菌水(9.9ml ,共15支左右) 泥土(教学楼或校外取土) 无菌平板(20个)、容量瓶等 (二)、实验步骤与安排
(三)、注意事项
1. 所有操作均需在无菌的条件下进行,以免影响结果。实验过程中,注意清洁卫生工作,保
持实验仪器的整理、清洁。
2. 每天必须有人前去观察实验结果、操作等,密切菌落的生长、形态等。 3. 熟练掌握各个操作步骤,要多讨论,多查参考资料。