有机溶剂沉淀法提取乳酸链球菌素的效果_鲁吉珂
84 2012, Vol. 33, No. 10
食品科学※工艺技术
有机溶剂沉淀法提取乳酸链球菌素的效果
鲁吉珂1，黎业娟1，吴霄玥1，刘 欣2，郝利民3
(1.郑州大学生物工程系，河南 郑州 450001；2.郑州奇泓生物科技有限公司，河南 郑州 450066；
3.总后勤部军需装备研究所，北京 100010)
摘 要：利用水微溶性有机溶剂二氯甲烷、正丁醇，采用沉淀法从发酵浓缩液中提取乳酸链球菌素。结果表明：在有机溶剂和发酵浓缩液体积比1:1条件下，丁醇提取乳酸链球菌素纯度可达到63.32%，单步沉淀收率24.3%，二氯甲烷提取产品纯度39.96%，沉淀收率36.04%；二氯甲烷和丁醇体积比1:1组成的复合溶剂，提取效果优于单一有机溶剂，产品纯度和单步收率分别为45.94%和59.3%。该方法可克服现有乳酸链球菌素提取工艺产品纯度低、盐含量高的缺陷，具有过程简便、产品纯度较高的优点，具有较好的工业化应用前景。关键词：沉淀；有机溶剂；乳酸链球菌素；发酵浓缩液；分离
Separation of Nisin from Fermentation Broth Concentrate by Organic Solvent Precipitation
LU Ji-ke1，LI Ye-juan1，WU Xiao-yue1，LIU Xin2，HAO Li-min3
(1. Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China；
2. Zhengzhou Qihong Biotechnology Co. Ltd., Zhengzhou 450066, China；
3. Quartermaster Equipment Institute of General Logistics Department of People,s Liberation Army, Beijing 100010, China)Abstract ：To obtain high purity nisin product through simple process with low cost, nisin was precipitated from fermentationbroth concentrated with organic solvents dichloromethane and n-butanol. Under 1:1 (V/V) conditions with butanol employed, thenisin purity was 63.32%, and the precipitation yield was 24.3%. While the purity and yield for dichloromethane was 39.96%and 36.04%, respectively. When a mixture of dichloromethane and butanol at a volume ratio of 1:1 was used, the nisin purity andthe precipitation yield was 45.94% and 59.3%, respectively. This new method overcame many disadvantages of the existingmethod, such as low purity and high salt content. So it shows great potential for industrial applications.Key words：precipitation；organic solvent；nisin；fermentation broth concentrate；separation
中图分类号：TQ465.92 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)10-0084-03
乳酸链球菌素(Nisin)又称乳球菌肽或乳链菌肽，是乳酸链球菌(Streptococcus lactis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)在代谢过程中产生的具有很强杀菌作用的多肽，一级结构由34个氨基酸组成，相对分子质量约为3500，通常以二聚体形式存在[1]。Nisin是一种天然食品防腐剂，具有抗菌性强、无毒、水溶性好、热稳定性好等优点，已被广泛应用于乳制品、罐头食品、肉制品和饮料的防腐保鲜[2]。
目前，工业上Nisin主要是采用发酵法生产。目前从发酵液中提取Nisin的方法主要有吸附法、盐析法、膜过滤法、有机溶剂法、泡沫分离法和双水相萃取法等[3-7]。
收稿日期：2011-11-07
吸附法是在发酵液中加入固体吸附剂如大孔树脂或者利用菌体细胞自身吸附乳酸链球菌素，解吸后将解吸液盐析或喷雾干燥，制成粉末状食品级Nisin产品[8]；膜过滤法首先用无机膜或管式膜从发酵液中除去菌体和固体等相对分子质量比乳酸链球菌素大的物质，再采用卷式膜超滤从发酵液中除去相对分子质量比乳酸链球菌素小的物质，得到发酵液浓缩物，最后加入固体食盐，经喷雾干燥制得食品级Nisin，产品中食盐含量为10%～50%[9]；有机溶剂法主要采用正丙醇和丙酮，将一定量正丙醇加入NaCl饱和的预处理后发酵液中，离心，上清液加入丙酮沉淀，冷冻干燥即得Nisin粉末[5]。也有
基金项目：郑州大学引进人才项目；郑州大学全国大学生创新创业训练计划项目(121045943)； 河南省教育厅科学技术研究重点项目(12B530005)
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※工艺技术食品科学
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表1 不同有机溶剂疏水常数logP值[16]
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文献[10-11]报道采用层析的方法纯化Nisin，采用G50介质的凝胶过滤层析，或者采用阳离子交换树脂D113的离子交换层析。
综上所述，目前Nisin的提取工艺主要采用的是盐析和喷雾干燥的方式，产品中以粉末状食品级Nisin为主，质量标准参照GB 2394—2007《食品添加剂：乳酸链球菌素》，产品效价不低于900IU/mg，NaCl含量不低于50%。由于盐含量高、纯度较低，并且提取步骤繁琐，纯化过程复杂，提取成本较高。Nisin层析工艺得到的产品纯度较高，但目前仍处于实验室研究阶段，成本和放大问题成为制约其工业化应用的主要瓶颈[12]。
传统有机溶剂法分离Nisin采用水溶性的正丙醇和丙酮，本研究提出的有机溶剂沉淀法利用微溶于水的有机溶剂回收高纯度Nisin，以发酵浓缩液为原料，制备含盐量低的高纯度Nisin制品，该方法目前尚未见文献报道。11.1
材料与方法
材料与试剂
Nisin发酵浓缩液(效价为51.8×104IU/mL) 郑州奇
Table 1 Hydrophobic constant (log P values) of different organic
solvents
有机溶剂logP
正己烷3.5
四氯化碳3
二氯甲烷0.93
丁醇0.8
乙酸乙酯0.68
丙酮0.28
丙醇－0.23
乙醇－0.24
2.1单一有机溶剂沉淀Nisin
首先采用单一有机溶剂沉淀法(表1)，对Nisin发酵浓缩液进行提纯，结果见表2。由表2可知，在有机溶剂与发酵浓缩液体积比为1:1的条件下，二氯甲烷和丁醇的提取效果较好：丁醇提取沉淀Nisin纯度可达63.32%，单步沉淀收率为24.3%，二氯甲烷提取沉淀纯度虽仅为39.96%，但沉淀收率为36.04%；四氯化碳沉淀Nisin收率较低，不到10%(表2)；将发酵浓缩液与丙酮、乙醇、丙醇、乙酸乙酯和正己烷按照体积1:1的比例分别混合均匀，均没有沉淀生成。综合沉淀收率和Nisin纯度两项指标，二氯甲烷和丁醇两种溶剂对Nisin的沉淀提取效果较好，而与其疏水常数相近的乙酸乙酯对Nisin没有沉淀作用；正己烷虽可与发酵浓缩液形成明显分层，但其对Nisin的沉淀效果不太理想(没有沉淀生成)。上述结果表明：溶剂疏水性差异可能不是决定Nisin分离提取的主要因素，而Nisin在有机相和水相的交界处富集浓缩存在溶剂特异性。
表2 单一有机溶剂沉淀Nisin实验结果
Table 2 Nisin precipitation results with single organic solvent有机溶剂丁醇二氯甲烷四氯化碳丙酮乙醇丙醇乙酸乙酯正己烷
实验现象
分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀
不分层，无沉淀不分层，无沉淀不分层，无沉淀分层无沉淀分层无沉淀
沉淀效价/(IU/mg)
[**************]—————
Nisin纯度/%63.3239.7632.73—————
沉淀收率/%24.336.049.2—————
泓生物科技有限公司；Nisin标准品 美国Sigma公司；丁醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、丙醇、四氯化碳、正己烷均为分析纯。1.2
方法
1.2.1 有机溶剂沉淀
取一定体积有机溶剂(或者一定比例混合的两种有机溶剂)，和一定体积Nisin发酵浓缩液置于分液漏斗中，混合均匀，3500r/min离心分层，水层和有机溶剂相分离，分别测量清液体积及效价，沉淀置于50℃真空干燥，测定质量及效价。1.2.2
Nisin效价测定
琼脂扩散法测定效价(GB 2394—2007)[13]。
沉淀质量×沉淀效价
单步沉淀收率(R)/%＝————————————————×100
发酵浓缩液体积×发酵浓缩液效价
2
结果与分析
有机溶剂沉淀法是向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低，水对蛋白表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液介电常数下降，蛋白质分子间静电引力增加，从而凝聚和沉淀[14]。Nisin是两性分子，具有倾向于膜蛋白的性质，可在有机相和水相的交界处富集浓缩[15]。本研究所选用的有机溶剂从疏水性较强的正己烷(疏水常数logP为3.5)，到亲水性较强的乙醇(logP为－0.24)，一共8种，见表1。
注：“—”表示无沉淀生成。实验条件：有机溶剂和Nisin发酵浓缩液体积比1:1置于分液漏斗中，混合均匀，3500r/min离心分层，水层和有机溶剂相分离，分别测量清液体积及效价，沉淀50℃真空烘干，测定质量及效价。
2.2增加有机溶剂用量沉淀Nisin
根据单一有机溶剂的实验结果，选取二氯甲烷和丁醇为沉淀溶剂，增加其用量进行Nisin提取实验，结果见表3。对二氯甲烷沉淀体系，增加二氯甲烷用量至发酵浓缩液体积2倍时，沉淀Nisin纯度为42.95%，此时单步沉淀收率为47.7%；和二氯甲烷与Nisin浓缩液体积比为1:1时相比，产品纯度略有提高；而增加丁醇用量
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至发酵浓缩液体积2倍时，Nisin纯度反而降低，由63.32%降至54.42%，但单步沉淀收率由24.3%升至43.5%。考虑到实际应用中增加溶剂用量会增加后续溶剂回收成本，因此选用有机溶剂与发酵浓缩液体积比为1:1的比例进行Nisin沉淀提取。
表3 增加有机溶剂用量沉淀Nisin实验结果
Table 3 Nisin precipitation results with increased organic solvent
amount
有机溶剂与浓缩液体积比二氯甲烷:浓缩液＝1:1二氯甲烷:浓缩液＝2:1二氯甲烷:浓缩液＝3:1丁醇:浓缩液＝1:1丁醇:浓缩液＝2:1
实验现象
分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀
沉淀效价/(IU/mg)[***********]821767
Nisin纯度/%39.7642.9518.9863.3254.42
沉淀收率/%36.0447.745.024.343.5
醇复合溶剂提取效果较好，产品纯度和单步收率分别为45.94%和59.3%。丁醇同甲醇、乙醇和丙酮组成的复合溶剂，同Nisin发酵浓缩液混合后不分层也无沉淀；丁醇和丙醇混合溶剂仅有微量沉淀；丁醇和乙酸乙酯混合溶剂提取Nisin对应的产品纯度和单步收率分别为54.64%和45.7%。上述实验结果说明：选用合适的复合有机溶剂会得到比单一溶剂更优的Nisin分离提纯效果；采用简单的有机溶剂沉淀方法可以得到纯度较高的Nisin产品(接近80%)；有机溶剂及其复合有机溶剂的选用对Nisin产品的纯度和收率均有显著影响。3
结 论
注：实验条件：有机溶剂和Nisin发酵浓缩液一定体积比置于分液漏斗中，混合均匀，3500r/min离心分层，水层和有机溶剂相分离，分别测量清液体积及效价，沉淀50℃真空烘干，测定质量及效价。
2.3复合有机溶剂沉淀
表4 复合有机溶剂沉淀Nisin结果
Table 4 Nisin precipitation results with complex organic solvents有机溶剂二氯甲烷-甲醇二氯甲烷-乙醇二氯甲烷-丙醇二氯甲烷-丁醇二氯甲烷-丙酮二氯甲烷-乙酸乙酯
丁醇-甲醇丁醇-乙醇丁醇-丙醇丁醇-丙酮丁醇-乙酸乙酯
实验现象
分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀分3层，中间少量褐色沉淀分3层，中间层褐色沉淀
不分层，无沉淀不分层，无沉淀微量沉淀不分层，无沉淀分3层，中间层褐色沉淀
沉淀效价/(IU/mg)[***********][1**********]3————21856
Nisin纯度/%29.6679.4955.0345.9440.2527.46————54.64
沉淀收率/%2614.424.659.35.711.7————45.7
针对现有Nisin提取工艺存在的成品盐含量高、提取工艺复杂、提取成本偏高的问题，提出了采用有机溶剂沉淀法提纯Nisin的新工艺。利用水微溶性有机溶剂二氯甲烷和丁醇，从Nisin发酵浓缩液中提取纯度较高的Nisin制品，具有过程简便、产品纯度较高等优点。在二氯甲烷和乙醇体积比1:1混合为复合溶剂条件下，提取Nisin沉淀纯度可达79.49%。尽管单步沉淀收率不高，但下一步可采用多步沉淀的方式来提高分离纯化的总收率。该课题的进一步研究开发，将具有较好的工业化应用前景。
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注：“—”表示无沉淀或者只有微量沉淀而未取样。实验条件：两种有机溶剂和Nisin发酵浓缩液体积比1:1:1置于分液漏斗中，混合均匀，3500r/min离心分层，水层和有机溶剂相分离，分别测量清液体积及效价，沉淀50℃真空烘干，测定质量及效价。
根据单一有机溶剂实验结果，选取二氯甲烷和丁醇为基础溶剂，分别将其与短链醇类、丙酮和乙酸乙酯组成体积比1:1的复合溶剂，再进行Nisin沉淀提取实验，结果见表4。其中二氯甲烷的上述复合溶剂，同Nisin发酵浓缩液混合离心后均分为3层，中间层为褐色沉淀：二氯甲烷和乙醇复合溶剂提取Nisin纯度最高，可达79.49%，但单步沉淀Nisin收率较低，仅为14.4%；结合收率和产品纯度两项指标综合考察，二氯甲烷和丁
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