农杆菌介导的植物基因转化研究进展

#综述进展#

农杆菌介导的植物基因转化研究进展

Progress of Plants Genetic Transformation by Agrobacteriu m

王景雪 孙 毅

Wang Jingxue Sun Yi

山西省农业生物技术研究中心, 太原030031

T he Ggr o-Biotechnology Center of Shanxi P rovince, T aiyuan 030031

摘 要: 农杆菌介导的植物基因转化是当今植物基因转化的主要方法之一, 因而深受关注。本文从农杆菌介导的基因转化机理, 植物对农杆菌侵染的反应, 转基因植物的遗传表达, 以及农杆菌对单子叶植物的转化等方面论述了该领域的最新研究进展, 并提出了进一步研究的方向。关键词: 土壤农杆菌; 基因转化; 遗传表达Abstract:

T he transformation mediated by A grobacter ium is an important approach in plant improvement, and the field

is concerned by many scientists. T his paper discussed r ecent prog resses in A gr obacter ium transfo rmat ion mechanism, plant response to the infect ion of A grobacter ium , the ex pression of foreign genes in tr ansgenic plants and monocotyledonous species transformation by Ag robacter ium. T he problem which need further inv est igation w as also di scussed. Key words : Agrobacterium; gene transformation; gene expression

植物基因转化是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入到受体植物的基因组, 并使其在后代植株中得以表达的过程。本世纪70年代初分子生物学研究领域取得的一系列重大进展, 为植物基因转化奠定了基础。1974年, 人们发现根癌农杆菌在感染植物时, 可将其中环状的Ti 质粒上的一段DNA 插入植物基因组中, 引起植物遗传特性的变化。从此, 人们开始尝试利用这种天然的载体系统, 将外源基因导入植物细胞, 并利用植物细胞的全能性, 借助于细胞培养或组织培养技术, 使转化细胞垌生成完整的转基因植株, 从而实现外源基因对植物的遗传转化。1983年获得了第一例转基因植物。1985年, Horsh 等人首创叶盘转化法, 使得转化过程大为简化。此后, 植物基因转化的研究得到了迅速发展

[1]

范围的限制, 仅仅局限于大多数双子叶植物。然而, 近年来, 由于在载体系统和转化方法研究上的进展, 农杆菌已在转化水稻、玉米、小麦、石刁柏等单子叶植物上取得了成功[2~

6]

。本文旨在介绍这些研究

的最新进展, 并从农杆菌和受体植物以及它们之间的相互作用等方面讨论转化过程中的一些问题, 以期为建立最佳的植物基因转化系统提供依据。

1 农杆菌介导的基因转化机理

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。现已发现, 与植物基因转化有关的有两种类型:一为根癌农杆菌(Agrobacter ium tumef aciens) , 它含有Ti 质粒, 能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤, 即诱发冠瘿瘤; 二为发根农杆菌(agr obacter ium rhizogenes ) , 它含有Ri 质粒, 能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。

Ti 质粒(包括Ri 质粒) 上有一段转移DNA (transfer DNA, 又称T -DNA) , 在农杆菌侵染植物时, 这段DNA 可以插入到植物基因组中, 使其携

。目前, 已有百余种转基因植物问世。在众

多的转基因植物中80%是由农杆菌介导转化的[1]。目前农杆菌已成为植物基因转化的首选方法。过去人们一直认为农杆菌介导的基因转化受农杆菌宿主

带的基因在植物中得以表达。由于T -DNA 能够进行高频率的转移, 而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到50kb 的外源基因。因此, T i 质粒和Ri 质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。1. 1 T-DNA 转移机理

T-DNA 转移是指T i(或Ri) 质粒上的转移DNA 被加工、切割、复制、越过细菌膜以及进入植物细胞并整合到植物基因组的全过程。

植物基因转化必须有Ti 质粒上T -DNA 和vir 基因即毒性区两部分的参与。

1) T -DNA

T -DNA 可以将其携带的外源基因整合到植物基因组中。但T-DNA 上的基因与T -DNA 的转移与整合无关。T -DNA 上较重要的是T -区两端左右边界各为25bp 的重复序列。其中14bp 是中心, 分10bp 和4bp 两组, 是完全保守的。这两个边界是T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重要。胭脂碱(Nopaline) 型农杆菌菌系的Ti 质粒上为单一的T-DNA 。只有左、右各一个边界序列。在章鱼碱(Octopine) 型菌系的T-DNA 上则有四个边界序列, 将T -DNA 右边界的右侧约17bp 以外有一个24bp 的超驱动序列, 为有效转移T -DNA 所必需, 起增强子作用。将其置于25bp 边界序列的上游或下游, 直到离边界6kb 仍有促进T -DNA 转移的作用。

2) vir 基因

与转化有关的基因包括农杆菌染色体基因和T i 质粒上的v ir 基因。染色体基因包括Ch -vA 和ChvB , att , pscA , ChvD 以及ChvB 。它们大多编码一些膜相关蛋白, 负责使细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对VirG 起激活作用。Ti 质粒的vir 区大小为30kb, 分Vir A 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7个操纵子, 一共有24个基因共同控制着T -DNA 的加工和转移, 它们总称调控子。

vir 基因的活化转录是在接受了植物细胞产生的创伤信号分子后开始的。首先是VirA 基因的活化。V irA 是一种结合在膜上的化学受体蛋白, 可直)

[1, 7~9]

接对植物产生的酚类化合物感应, 其感应部位可能位于胞质域。VirA 蛋白的胞质域有自激酶的功能, 可在保守的组氨酸残基上, 从而使VirG 蛋白活化。VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白, 可以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域, 从而成为其它vir 基因转录的激活因子, 打开VirB 、C 、D 、E 、H 等几个基因。

3) T -DNA 复合物的跨膜转移

激活了的VirG 蛋白与各v ir 基因5. 端非转录区的/毒性盒0序列相结合, 启动各毒性区的转录, vir 区组成T-DNA 复合物向植物细胞转移的膜通道。V irD1作为拓扑异构酶与VirD2协同在T -DNA 两未端序列处通过缺口剪切, 将T -DNA 从Ti 质粒上剪切下。在章鱼碱型菌系中这一过程需要VirD2右端序列外侧的增强驱动序列结合, 帮助缺口的生成。然后, VirD2与T -DNA 链结合。新的T -DNA 底链以上链为模板, 从右端产生的DNA 缺口处由5. ) 3. 方向进行合成。被取代的旧链游离出来, 与许多E2蛋白分子结合组成T 复合物。合成的T 复合物经过VirB 区蛋白组成的膜通道, 以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内, 并在VirD2和VirE2的亲核序列引导下, 以VirD2为先导向植物细胞核运动。Vir 基因和T -DNA 可以位于同一个质粒上, 也可以位于不同的质粒上。

1. 2 农杆菌T i 质粒载体系统

目前, 人们已经构建成了若干种能应用于植物基因转化的农杆菌Ti 质粒载体系统。所有这些系统都包括了两个基本要素。第一, 组成一个重组的质粒载体。它含有T -DNA 的边界序列, 而且这个质粒还能够在大肠杆菌和农杆菌之间进行穿梭。这是由于Ti 质粒是一个大质粒, 很难在其上进行普通的基因克隆操作, 必须使用一种中间载体质粒, 在大肠杆菌上进行普通的基因操作, 连接上外源基因, 然后转移到土壤农杆菌中, 与相应的Disarmed Ti 质粒共同作用组成一个完整的Ti 质粒载体系统。第二, 作为载体系统的质粒及农杆菌株必须含有完整的vir 基因[10]。

目前, 在植物基因转化中应用最多的Ti 质粒载体系统有共整合载体系统和双元载体系统。共整合

载体是指T i 质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322DNA 所取代, 带外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后, 二者相同的pBR322序列发生同源重组, 外源基因就此整合到disarmed Ti 质粒上。双元载体系统是指在一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒。一个质粒含有T-DNA 和外源基因重组的多功能克隆载体质粒。它既能够在大肠杆菌中复制, 又能在农杆菌中进行复制, 并能够从大肠杆菌迁移到土壤农杆菌中。另一个质粒是含有vir 基因的T i 衍生质粒, 如pGV2260。近年来, 科学家又构建出了一种超级双元载体(Superbinary vector) , 主要用于农杆菌对单子叶植物的转化。

能刺激vir 基因的活性[1, 12]。Zerback 等(1989) 在矮牵牛的花粉提取物中发现黄酮类化合物-堪非醇3-葡糖基半乳糖苷及栎皮酮3-葡糖基半乳糖苷, 对vir 基因具有弱诱导作用[13]。M orris(1990) 发现在桉树中, 木质素的前体松柏苷可被农杆菌的葡糖苷酶水解成为松柏醇, 成为vir 基因的诱导剂。试验证明, 芥子酸也具有对vir 基因的激活作用。

某些转录抑制剂如放线菌酮(戊二酰) 、亚胺环酮(Cyclohex iuinde) 能抑制vir 基因的活化。有试验表明, 如果植物细胞首先与放线菌酮共培养, 则后来v ir 基因活化被明显抑制。农杆菌v ir 基因的诱导要求植物细胞具有活跃的新陈代谢, 坏死的植物细胞则不能诱导vir 基因活化。用vir 基因活化诱导物或双子叶植物如马铃薯的伤流液处理, 已使许多植物如金鱼草、拟南芥、白菜型油菜、大豆、烟草、番茄、水稻、玉米、小麦、甜菜、白三叶草、猕猴桃等的转化频率提高[15~

25]

[14]

2 植物对农杆菌侵染的反应

植物在受到带有外源基因的农杆菌侵染后, 能否实现外源基因的转化, 还要取决于植物受体系统的反应, 这种反应主要表现在两方面:创伤反应及

v ir 基因活化; 及细胞的感受态。2. 1 创伤反应及vir 基因活化

T -DNA 的转化是随着细菌进入植物伤口开始的; 创伤反应对于转化是必要的。大多数双子叶植物组织在受到创伤后, 诱导植物细胞分泌某些酚类物质, 这些酚类物质即成为创伤信号分子或创伤诱导分子。农杆菌对这些酚类化合物具有趋化性, 而且这些酚类化合物还作为创伤诱导分子诱导农杆菌vir 基因活化及表达。据报道, 它们是一类分子量低于1000的小分子酚类化合物, 对冷、热处理稳定, 部分疏水, 虽然能耐极度的pH, 但对诱导vir 基因活化而言, 则需pH 低于6. 0[10]。1985年Stachel 等人从代谢活跃的烟草根、叶及愈伤组织的提取物中分离得到乙酰丁香酮(acetosyringone, 简称AS) , 羟基乙酰丁香酮(ahy drox yacetosy ringone, 简称OH -AS) , 并证明它是vir 基因的天然诱导剂。

农杆菌vir 区基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后转录活化, 首先激活VirA 基因。AS 是亲脂化合物, 很易在细菌的内膜中积累。酚类化合物对vir 基因的诱导反应主要部位是在VirA 蛋白中靠近第二跨膜区的第283~323氨基酸区段。另外, 植物酚类化合物, 包括儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、对羟苯甲酸、3, 4-二羟苯甲酸、香草醛等都

[11]

。Veluthambi 等(1989) 报告,

在农杆菌侵染时用AS 或AS+nopaline 处理棉花受

伤的顶端分生组织提高了转化效率[26]。James 等(1993) 在苹果叶片转化中同时加AS 及渗透稳定剂甜菜碱或脯氨酸, 促进了GU S 基因的表达。除了vir 基因的活化物以外, 低pH 值的培养基, 低磷酸盐和合适的碳源将有利于T -DNA 的转移[1, 17]。2. 2 植物细胞对农杆菌侵染的感受态

自1985年H orsch 等人首创叶盘法转化成功后, 应用于基因转化的外植物体种类迅速增加。综合文献资料表明:叶片(叶柄) 、茎(花茎、匍状茎) 、子叶(子叶柄) 、下胚轴(上胚轴) 是目前应用最成功的外植物体材料, 分别占文献报道的35%、17%、9%和10%[27]。

不同植物种所要求的外植物体种类不同。同一物种中, 不同的外植体会有不同的转化效果。在苜蓿属的M. var ia 中, 试管苗叶片的转化频率比叶柄高出4倍[28]。在拟南芥中, 不同的生态型和外植体以及菌株之间都表现出转化频率上的差异。Schlappi 和Hohn (1992) 用农杆菌感染三个玉米品系不同发育时期的幼胚时发现, 幼胚中分生组织尚未分化时, 农杆菌不能侵染; 当幼胚开始分化第1~2小叶时, 侵染率为7%~32%; 授粉后14~16天的幼胚, 侵染率为32%~73%[29]。所有这些差异都

21]

表明:植物细胞对农杆菌的侵染存在一个感受态。

植物细胞的感受态是指植物细胞转化时易于接受外来遗传住处的一种状态。毫无疑问, 植物细胞的感受态与转化频率直接相关。一个成功的转化是植物与农杆菌共同作用的结果, 植物细胞处于对农杆菌良好的感受态时, 才能有效地接受外源DNA 并使其得以整合和表达。Potry kus 认为, 只有在对农杆菌具感受态细胞中才能得到转化植株, 而创伤反应是感受态细胞存在的前提条件。植物细胞的感受态还与植物激素以及Ca 有关。植物激素是信息传递的第一信使, 其功能的发挥还有赖于第二信使Ca 2+的参与。张根义等(1997) 的研究表明, 在植物转化时, 适当的生长素和细胞分裂素处理将使植物细胞的感受态增强; 而高浓度的Ca 2+则大大提高了转化率[30]。

M ukhopadhy ay A. 等(1992) 年发现, 在用农杆菌侵染Brassica camp estris 时发现下胚轴作外植物体时得到7%~13%的转化率, 而子叶作外植体时却未得到真正的转化幼苗[31]。我们用农杆菌转化芥菜型油菜Brassica j uncea 时发现子叶和下胚轴虽然都能得到转化的幼苗, 但由下胚轴得到的幼苗却比由子叶得到的幼苗较难生根。

2+

对区彼此靠得很近, 位于配对区中间的T-DNA 突出成环状结构; »T-DNA 配对区外两个突出的单链尾巴被切去。T-DNA 右边界5. 端与v irD 蛋白相连, 整合时, 碱基不被切去或切去很少, 直接与植物DNA 相连。而T -DNA 左边界则有较大变化, T -DNA 左边界切去片段的长短取决于同靶DNA 配对的左侧同源区的位置, 如接近左边界的碱基同靶DNA 配对, 切去就少。若远离左边界的碱基同靶DNA 配对, 切去就多; ¼T-DNA 同靶DNA 未端连接; ½在靶DNA 的另一条链上切割, 产生一游离3. 末端, 以此3. 端为引物, T -DNA 链为模板, 在DNA 聚合酶的催化下合成T -DNA 第二链[32]。而M ayerhofer 等(1991) 认为:T-DNA 整合时, 可在植物靶DNA 处造成29-73bp 的碱基缺失。T -DNA 的右边界在T -DNA 的整合中对于靶DNA 位点的识别具有重要作用[33]。3. 2 转基因植株的遗传行为

分子杂交结果证明, 在农杆菌介导的转基因植株中, 外源基因的拷贝数大多为1~5个左右, 但也有高达几十个的报道。一般在同一个转化事件中, 单拷贝的转基因植株约占总转基因植株的一半以下。小麦中大约有35%的转基因植株是单株贝[4]。与基因枪法介导的植物遗传转化相比, 农杆菌法可获得较多的单拷贝转基因植株。转基因植株的遗传传递行为符合孟德尔的遗传规律, 单拷贝转基因植株后代的遗传分离比一般为3B 1, 而多拷贝转基因植株的遗传行为有时表现为多基因的分离比, 有时由于多拷贝造成转基因失活而表现为不规则的分离。

3. 3 影响转基因表达的主要因素

1) 表达载体的表达效率

转基因植物外源基因的表达直接受表达载体的表达效率影响。为了提高表达载体的表达效率, 人们对基因调控序列的研究不断深入。目前, 对表达载体的研究主要集中于以下几个方面:

¹选择强启动子和非组成型启动子。在不同转基因植物中, 来源不同的启动子表达效率有明显差异, 通常来自于单子叶植物的启动子, 在单子叶植物中的表达效率比在双子叶植物中高得多, 反之亦然。Actin 、U bi 和Emu 启动子在单子叶植物中的表达效

[33]

3 转基因的遗传表达

3. 1 外源基因在植物体内的整合

分子杂交结果表明, T -DNA 在植物染色体中的整合是随机发生的, 既可以单拷贝方式整合, 也可

以多拷贝方式整合。T -DNA 的整合虽然是随机发生的, 但有许多研究表明, T -DNA 优先整合到转录活跃区, 这可能是由于这些区域易解开并易被切割, 因而与处于紧密螺旋状态的转录不活跃区相比之下更有利于T -DNA 整合。而且T -DNA 整合到转录活跃区后, 有利于T -DNA 上基因的表达, 在选择上占优势。

T-DNA 的整合模型:Gheysen 等(1991) 提出的T-DNA 整合模型, 主要以T -DNA 与植物靶DNA 联合复合体上少量碱基配对, 并在连接处以DNA 修复为基础。其过程为, ¹植物细胞通过各种途径在靶DNA 处形成缺口。ºT -DNA 接近靶DNA 的缺口, 其两端通过少数几个同源碱基同缺口处的单链靶DNA 配对, 形成一异源双链区, 两个配[32, 33]

率远高于双子叶植物; 而35S 启动子在双子叶植物中的表达效率远高于单子叶植物。这可能是由于单、双子叶植物基因表达的分子机制有所不同, 也可能是两者在转录因子和启动子序列识别方面有差异。非组成型启动子在特定条件诱导下, 或在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。这类启动子避免了外源基因持续表达所造成的细胞能量的浪费和由此造成的对细胞正常生理活动的干扰。

º利用内含子增加启动子的表达效率

有研究证明, 在启动子和报告基因之间插入单子叶植物基因的内含子可提高基因在单子叶植物中的表达效率[34]。如Cheng 等(1997) 利用35S 启动子和H SP70内含子构建的农杆菌表达载体在小麦上得到了高达4. 3%的转化频率。另外, 在启动子附近插入增强子也能提高表达效率[35]。

2) 拷贝数

大多数转基因失活都涉及多拷贝的转基因。这可能是由于重复顺序之间通过异位配对造成染色体构型的变化。这种变化的结果之一是重复顺序位置染色质发生收缩, 从空间上阻碍了转录因子与转基因的接触, 使基因处于关闭状态

3) DNA 甲基化修饰

[36][4]

在体细胞变异, 组培引起体细胞变异是常见现象。所转基因也能与其它基因发生相互作用, 从而引起性状变异。

4 农杆菌与单子叶植物转化

农杆菌对植物的有效转化取决于两个条件:第一, 农杆菌能否将T -DNA 转入植物细胞; 第二, 植物感受态细胞的存在。大多数双子叶植物具有明显的创伤反应, 能够满足以上两个条件, 从而使转化易成功。大多数单子叶植物和极少数的双子叶植物不具有明显的创伤反应, 农杆菌对这类植物转化的可能性一直是一个探讨的热点[6]。¹农杆菌转化单子叶植物的一个障碍可能来自于vir 基因的诱导, 主要是由于缺乏创伤反应, 细胞伤流液中不含有vir 基因诱导物。虽然Usam i 等(1988) 发现, 在小麦和燕麦的细胞伤流液中含有多酚类物质, 但是这些物质由于具有相对比较高的分子量和亲水性而不同于先前发现的vir 基因的诱导物[10]。Sahi 等(1990) 发现, 玉米幼苗合成的一种叫DIM BOA (2, 4-dihy -droxy-7-methoxy -2H -1, 4-benZOxazin-3(4H) -one) 的物质能够抑制农杆菌生长和抑制由AS 诱导的v ir 基因活化。º影响农杆菌转化单子叶植物的另一个因素是能否富集感受态细胞。这主要靠对农杆菌菌株和植物基因型进行大量筛选, 也许可以找到适合某种菌株的基因型并由此产生一些感受态细胞或者是通过寻找某一特定器官在发育过程中某一特定时期所产生的感受态细胞。所幸的是, 近年来, 农杆菌对单子叶植物的转化已取得了可喜的进展, 现已在水稻、玉米、小麦等植物上获得了转基因植株。这引起成功的转化可主要归结为:¹在用农杆菌进行共培养时加入vir 基因活化剂, 如AS, OH-AS, 双子叶植物伤流液等[25, 12]; º筛选例行的农杆菌载体, 特别是采用超级双元载体系统。共培养时对菌的浓度有较为严格的限制, 过高、过低都不能进行有效转化; »对外植体进行选择, 大都采用某一个发育阶段的未成熟胚进行转化, 而且胚的大小有较严格的限制。如玉米胚的大小为2. 0~2. 5mm, 菌浓度为1. 0@108cfu/mL, 大于5. 0@109cfu/mL 和小于1. 0@107cfu/mL, 均不能得到转化植株, ¼选择合适的基因型和培养基。

[10]

。

多拷贝的转化易发生DNA 的甲基化修饰, 甲基化修饰的位置仅限于转基因本身, 并不扩散到转基因两侧低位甲基化顺序。在细胞中可能存在某种

识别外源DNA 插入顺序, 并对其加以修饰的机制。

植物体内通常有20%~30%胞嘧啶是甲基化的, 农杆菌内T-DNA 的胞嘧啶也有0. 5%是甲基化的。外源基因可以在体外甲基化, 因而在转入植物体后表达力降低; 其转入植物后也可能被甲基化, 从而影响表达。甲基化程度与基因有关。在用gus 和np t Ò基因转化马铃薯时发现, gusA 基因的启动子和结构基因都有甲基化, GU S 活性在不同转基因植株中差别很大; 而np t Ò基因则无甲基化, 不管是否加kan 进行选择, 产生的转基因植株都抗kan, 说明gus 比npt Ò更易被甲基化[37]。

4) 转基因对非转基因性状的影响

转基因往往具有多效性, 对转基因植物中的非编码性状有影响, patatin 启动子驱动的GUS 基因可使转基因马铃薯的薯块重量增加。转基因植物存

5 结论

)

农杆菌介导的植物遗传转化虽然已成为当今植物遗传转化的主流, 但仍需对一些问题做进一步研究。

1) 基因型的依赖性

转化频率与植物的基因型具有很大的关系, 即使在转化频率比较高的植物中(如马铃薯、烟草、拟南芥等) 也有很大的基因型依赖性。

2) 宿主范围的限制

对单子叶植物尤其是禾谷类作物的转化仍受到限制。

3) 农杆菌与受感染植物之间的相互作用农杆菌与受感染植物之间相互作用产生的过敏反应导致感染部位褐化或坏死, 从而影响转化效率, 如芸苔属作物。

4) 可再生细胞部位与转化感受态细胞部位不一致, 导致假转化体的出现和转化效率降低。植物外源基因导入对于研究植物的发育调控及农作物的遗传改良具有重要的意义, 因而在短短的十余年间取得了重大的进展。转基因植物的数量与日俱增, 农杆菌介导的植物基因转化方法也已有很大发展。许多转基因植物都已经或正在进入田间试验阶段, 转基因抗虫棉、抗虫玉米、抗病小麦等已经在商业化生产。利用基因工程解决农业生产的难题已为时不远。相信随着我们的不断努力, 基因工程将会为农业生产作出应有的贡献。

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