2实体肿瘤组织微血管计数方法的探讨

・111・

蛋白(LRP ) 的关系及意义。

一、材料和方法

1. 材料:收集武汉大学中南医院病理科1996—2000年

色体动态平衡, 从而促使细胞的永生化及肿瘤的形成。端粒酶对DNA 的保护作用还能降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[1]。hTERT 是端粒酶活性的限速因子, hTERT 的表达水平基本可反映端粒酶的活性, 故经化疗有效的肿瘤组织可见

hTERT 的表达下降

[2]

间手术切除并经病理确诊的NSC LC 共113例, 术前均未经放化疗。男性91例, 女性22例, 年龄34～77岁, 中位年龄为57岁。其中鳞癌39例, 腺癌61例, 腺鳞癌13例。高分化43例, 中等分化47例, 低分化23例。有淋巴结转移者37例, 无淋巴结转移者53例, 另有23例无送检淋巴结。按国际T NM 分期法, Ⅰ期52例, Ⅱ期26例, Ⅲ期11例, Ⅳ期1例, 另有23例缺乏相关临床资料。标本均经4%中性甲醛液固定, 石蜡包埋, 连续切片厚4～5μm 。

2. 原位杂交及免疫组织化学检测:所用地高辛标记hTERT 寡核苷酸探针购于武汉博士德生物工程有限公司, 实

。本研究中hTERT mRNA 与MRP 的

表达高度相关, 与LRP 的表达无相关性, 表明端粒酶可能系一新的耐药相关因素, 提示端粒酶抑制剂对逆转NSC LC 固有耐药性可能有潜在的广泛应用价值, 且对端粒酶阳性患者治疗时, 应慎用与MRP 耐药有关的抗癌药物。端粒酶与多药耐药相关基因的内在关系还需要进一步的研究。

具有MDR 表型的细胞常呈现出凋亡抗性, 凋亡抗性可能是MDR 的本质之一[3]。在p53表达缺失时, 肿瘤细胞对化疗药物的敏感性提高[4]。bcl 22是凋亡抑制基因, 其过度]S29核糖体蛋白引起

bcl 22表达降

验中设立阳性及阴性对照。即用型MRP 、LRP 、突变型p53、

bcl 22单克隆抗体及SP 免疫组织化学试剂盒购于福州迈新

生物技术公司。用已知的阳性片作阳性对照, P BS 代替一抗作阴性对照。

3. 结果判断:采用双盲法计数1000, 。本研究中突变型p53与bcl 22的表达有, 二者协同表达抑制NSCLC 中的细胞凋亡, 但与

MRP 、LRP 的表达均无相关性, 提示p53、bcl 22基因不能影响MDR 表型, 推测MDR 表达与细胞凋亡可能属于不同基因调

4. 统计学分析:. 5, 结果

2

采用χ检验。P

控系列。

参

考

文

献

二、结果

1. NSCLC 中MDR 相关蛋白、hTERT mRNA 与细胞凋亡

基因产物的表达:除突变型p53定位于胞核外, MRP 、LRP 、

hTERT mRNA 、bcl 22均主要定位于癌细胞胞质中。阳性产物

呈弥漫或散在的棕黄色分布。各指标阳性表达率如下:

hTERT mRNA 为8015%(91/113) 、MRP 为7916%(90/113) 、LRP 为8016%(91/113) 、突变型p53为6119%(70/113) 、bcl 22为6811%(77/113) 。

2. MRP 、LRP 、hTERT mRNA 、突变型p53、bcl 22表达之间

的相关性:经统计学处理, MRP 与LRP (r =01307, P =

01001) 、突变型p53与bcl 22(r =01204, P =0103) 的表达具

高度相关性; hTERT mRNA 与MRP 的表达显著相关(r =

01251, P =01008) , 与I RP 的表达无相关性(P >0105) 。突

变型p53、bcl 22的表达与MRP 、LRP 的表达均不相关(P 均>

0105) 。

1Kuranaga N, Shinom iya N, Mochizuki H. Long 2ter m cultivati on of

col orectal carcinoma cells with anti 2cancer drugs induces drug resistance and tel omere el ongati on:an in vitr o study . BMC Cancer, 2001, 1:10217.

2I czowski K A, Huang W , Mazzucchelli R, et al . Andr ogen ablati on therapy f or p r ostate carcinoma supp resses the i m munoreactive tel omerase subunit hTERT . Cancer, 2004, 100:2942299. 3Come MG, Skladanowski A, Larsen AK, et al . Dual nechanis m of daunorubicin 2induced death in both sensitive and MDR 2resistant HL 260cells . B r J Cancer, 1999, 79:109021097. 4W ang QJ, Back W T . Transcri p ti onal supp ressi on of multidrug resistance 2ass ociated p r otein gene exp ressi on by wild 2type p53. Cancer Res, 1998, 58:576225769. 5Khanna N, Sen S, Shar ma H, et al . S29ribos omal p r otein induces apop t osis in H520cells and sensitizes the m t o che motherapy . B i oche m B i ophys Res Commun, 2003, 304:26235.

(收稿日期:2004205231)

三、讨论

端粒酶激活可延长和保护端粒DNA 重复系列, 维持染

(本文编辑:齐文安)

实体肿瘤组织微血管计数方法的探讨

许进　夏潮涌　周序珑　杜洪

　　鉴于不同研究中采用的微血管标记抗体、评判标准及计

数方法等各有不同, 使各研究间微血管密度(MVD ) 计数的临床意义缺乏可比性, 因此, 我们试图探索更客观、准确和标

作者单位:510180广州市第一人民医院病理科[许进(Email:

xujin_star@21cn. com ) 、杜洪];暨南大学医学院组织胚胎学教研室(夏潮涌) , 病理解剖学教研室(周序珑)

准化的评估实体肿瘤血管新生程度的方法。

一、材料与方法

收集1997年12月—2001年7月暨南大学第一附属医

・112・院及广州市第一人民医院住院手术治疗并经病理证实的女性乳腺导管癌的存档石蜡包埋标本76例, 选取同期的女性良性乳腺增生病变标本及癌旁正常乳腺组织20例作为对照。3μm 厚组织切片, 免疫组织化学染色采用SP 法, 第八因子相关抗原(F ⅧRAg ) 多克隆抗体购自Maxi m 公司, 广谱

SP 试剂盒购自福州迈新公司。以P BS 液(0101mol/L,pH714) 替代一抗为阴性对照。彩色摄像头摄像, 自制体视

血管, 所选的“热区”只反映了血管分布的最密集区而非血管新生的最活跃区; 而在低倍镜下确定的血管最密集区当转到高倍镜下计数时, 往往很难正好对准血管分布最密的区域; 此外, 在血管分布较密集的情况下, 目镜下用肉眼计数很容易出现漏数或重数等较大偏差。总之, 我们认为传统“热区”微血管计数法不仅很难反映肿瘤组织中真实的血管新生程度, 而且以“每视野”作为计算“密度”的尺度使不同研究中的MVD 临床意义也缺乏可比性。

对于上述问题, 有学者做了新的探索[1, 2], Edel 等[1]首次采用了系统抽样的方法、以单位面积为计量单位并通过计算机图像分析系统对乳腺癌组织血管新生的强度进行评估。本研究参考Edel 等的方法, 采用大样本均匀随机抽样代替人为选择数个“热区”的方法, 结果显示从良性病变→原位癌→浸润癌, MVD ; 将导管原位癌除外仅对MVD 在淋巴结转, 但随着转移的发生, 提示该指标在判断预后方面可能有一定价Edel 等[1]及Oga wa 等[3]对浸润性导管癌研究的结果相似。本研究中采用的方法在计数过程中应用计算机图像分析系统, 使观测视场放大, 血管与组织间关系显示更清晰; 使用无偏计数框网格胶膜逐格逐行计数微血管, 使计数过程更为准确; 以单位面积(mm 2) 组织内的MVNA 作为体现血管新生程度的指标, 真正体现了“密度”这一概念。只要标记血管所用的标记物相同, 不同研究间的结果并不受肿瘤的种类、组织的大小以及放大倍率(包括光学放大及电子放大) 不同的影响。均可进行比较分析。本方法需用设备较简单、可靠, 可普及至国内大多数实验室及病理科应用。当然, 要建立一个能客观反映新生血管生成程度的实用方法还有待进一步探索, 但应用大样本系统均匀抽样、无偏计数框计数和微血管面数密度指标应是今后的发展趋势。

参

考

文

献

学无偏计数框胶膜(25×16正方形网格, 边长1c m ) 贴于显示图像的15吋纯平彩色显示器正中, 以物镜测微尺标定正方形网格的几何尺寸。微血管判断标准及计数方法[1]:以镜下胞质内有棕黄色颗粒为血管内皮细胞阳性判断标准。肿瘤区域内单个或成丛的内皮细胞, 不管成腔与否均视为单个微血管, 凡管径大于8个红细胞或有肌层的血管不予计数。计数过程参考Edel 等[3]的方法:每张切片除过染区、组织破碎区及肿瘤坏死区外, 不论肿瘤实质区还是间质区均为检测对象。观测视场的抽样:25×物镜下, 从组织切片左上角第一个完整的可计数视野开始, 横向自左向右, 野抽取一个观测视野, 野, 再转到下一行, , 抽取视野。示屏上, 。把无偏计数框网格胶膜贴在显示屏上逐格逐行进行微血管计数。根据物镜测微尺标定每个实际观测视场的面积为260μm ×170μm, 每张切片抽取60个视场, 总观测面积为21652×21652mm, 基本可保证采样均匀覆及整张切片。将60个视场的微血管数总和除以总观测面积所得单位面积(mm 2) 组织内的微血管数记为微血管面数密度(the m icr ovessel nu mber of per unit area,

MVNA ) 。

二、结果

1. 肿瘤组织内新生血管的形态特点:肿瘤性血管:分支

紊乱、管腔不规则、单个及成簇排列的内皮细胞多见; 良性增生病变的血管:血管壁完整、管腔规则。

21不同病变类型乳腺组织MVNA 的比较:良性组织与

导管原位癌、良性增生组织与浸润性导管癌、导管原位癌与浸润性导管癌间的MVNA 差异均有统计学意义(P 0105) , 但随着转移的发生MVNA 有增高的趋势。

三、讨论

如何尽可能减少主观因素影响, 随机化原则的贯彻以及检测过程的标准化是定量分析的前提条件。我们发现, 在乳腺癌组织中“热区”有时并不能真实反映血管新生的程度。对于后一个问题, 在10×物镜下, 很难区分厚壁血管和新生

1Edel MJ, Robbins P D, Papadi m itri ou J M , et al . A ssess ment of

vascularity in carcinoma by computer 2assisted video analysis (CAVA ) and its ass ociati on with axillary ly mph node status . B reast Cancer Res Treat, 1998, 47:17227.

2Kat o T, Ki m ura T, IshiiN , et al . The methodol ogy of quantitati on of m icr ovessel density and p r ognostic value of neovascularizati on ass ociated with l ong 2ter m survival in Japanese patients with breast cancer . B reast Cancer Res Treat, 1999, 53:19231. 3Oga wa Y, Chung YS, Nakata B , et al . M icr ovessel quantitati on in invasive breast cancer by staining for fact or Ⅷ2related antigen . B r J Cancer, 1995, 71:129721301.

(收稿日期:2004203209)

(本文编辑:霍临明)